苗志國，羅志鵬，魏海云，呂巧莉，吳芳庚

結(jié)直腸癌是常見的胃腸道惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率較高[1]?，F(xiàn)階段，結(jié)直腸癌的治療手段仍以手術(shù)治療及放療、化療為主，但治療后的5年生存率僅有50%[2]。因此，進(jìn)一步深入研究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對發(fā)掘新的干預(yù)靶點，開發(fā)新型靶向治療藥物，制定有效的結(jié)直腸癌防治方案，最終改善患者預(yù)后至關(guān)重要。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與基因的異常調(diào)控密切相關(guān)，但是既往對結(jié)直腸癌的研究重點放在傳統(tǒng)的編碼基因，而近年來隨著微陣列技術(shù)與核酸測序技術(shù)的飛躍發(fā)展，越來越多不具有編碼蛋白能力的非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)并逐漸引起關(guān)注。相關(guān)研究[3-4]指出，lncRNA參與轉(zhuǎn)錄沉默、轉(zhuǎn)錄激活、染色體修飾、核內(nèi)運輸?shù)裙δ?，另外，其與免疫性疾病、心血管疾病、糖尿病等疾病發(fā)展密切相關(guān)，特別是惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。相關(guān)研究[6]顯示，lncRNA ATB高表達(dá)與結(jié)直腸癌的腫瘤體積、T分期、血管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。還有研究[7]發(fā)現(xiàn)，LncRNA AOC4P在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)減少，與臨床病理特征顯著相關(guān),是患者預(yù)后生存的獨立因素。研究[8]發(fā)現(xiàn)，lncRNA DANCR在結(jié)直腸患者癌組織和腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且其過表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的臨床分期、腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移顯著相關(guān)?，F(xiàn)階段，尚未有關(guān)于Linc01555和結(jié)直腸癌的相關(guān)研究，所以本文旨在通過實驗觀察Linc01555對結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)特點及并分析其對結(jié)直腸癌增殖、遷移、侵襲的影響，試圖為結(jié)直腸癌的診斷、治療及預(yù)后提供新的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年1—12月來我院進(jìn)行手術(shù)治療的100例結(jié)直腸癌患者為研究對象，術(shù)中收集患者結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織(取距腫瘤邊緣5 cm，經(jīng)快速病理檢查確定為正常組織，且切緣腫瘤細(xì)胞存留為陰性的組織)進(jìn)行檢測。研究對象年齡30～65(45.20±10.50)歲；男58例，女42例；TNM分期：I-II期62例，III-IV期38例；病理分級：I級48例，II級36例，III級16例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：陽性21例，陰性79例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)100例結(jié)直腸癌患者均經(jīng)過病理學(xué)檢查確診為結(jié)直腸癌；(2)100例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行手術(shù)治療前未經(jīng)過放、化療等治療；(3)100例結(jié)直腸癌患者的臨床資料均完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者伴有器官功能障礙；(2)腫瘤出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；(3)患者意識不清不能配合實驗進(jìn)行。本研究得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且所有患者及其家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析Linc01555水平 通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析100例結(jié)直腸癌樣本及100例結(jié)直腸癌旁組織樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)，通過limma包對數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，并提取Linc01555在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)值用于比較分析其表達(dá)水平差異。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)直腸癌細(xì)胞(SW480)置于含10%胎牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集處于對數(shù)生長期的結(jié)直腸癌細(xì)胞，接種于6孔板(5×105/孔)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時，根據(jù)Invitrogen公司Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染處理，將過表達(dá)lncRNA Linc01555質(zhì)粒和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，分別記為sh-Linc01555組和sh-NC組，培養(yǎng)6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后進(jìn)行后續(xù)實驗研究。

1.2.4 Linc01555對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響 收集對數(shù)生長期各組結(jié)直腸癌細(xì)胞，分別接種于96孔板中，密度為3×103個/孔，將過表達(dá)lncRNA Linc01555質(zhì)粒和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染12、24和36 h之后，向每孔加入20 μ的CCK-8試劑，培養(yǎng)時間2 h，于波長為450 nm下使用酶標(biāo)儀測定吸光度值，然后據(jù)此繪制一套吸光度值與濃度之間的生長曲線，觀察結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖情況。

1.2.5 Linc01555對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響 PBS洗滌細(xì)胞樣品后加入0.125%不含EDTA的胰蛋白酶消化，消化后懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)至離心管中DMEM終止消化并吹打混勻，低速離心5 min, 棄上清, PBS重懸細(xì)胞至濃度為106/mL，按說明書取重懸后細(xì)胞離心取沉淀后順次加入Binding Buffer, FITC熒光標(biāo)記的Annexin V試劑及Propidium Iodide (PI) 試劑，混勻、避光反應(yīng)后, 再次加入Binding Buffer并上流式細(xì)胞儀檢測各組凋亡率。

1.2.6 Linc01555對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響 采用Transwell遷移和侵襲實驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲情況。收集轉(zhuǎn)染24 h后的結(jié)直腸癌細(xì)胞，采用不含有胎牛血清的DEME培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行重懸，將細(xì)胞的濃度調(diào)整至2×105/100 μL接種于Transwell培養(yǎng)板上室(侵襲實驗所用上室經(jīng)10% Matrigel膠預(yù)包被處理)，下室加入550μl含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取出小室，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5%結(jié)晶紫溶液染色，顯微鏡下取5個高倍視野進(jìn)行拍照，計算細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織Linc01555相對表達(dá)量比較 結(jié)直腸癌組織Linc01555相對表達(dá)量(20.44±4.56)顯著高于癌旁組織(7.65±1.22)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 Linc01555相對表達(dá)量比較

2.2 結(jié)直腸癌患者Linc01555水平與臨床病理資料的相關(guān)性 以Linc01555的相對表達(dá)量中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，將結(jié)直腸癌患者分為Linc01555低表達(dá)組和高表達(dá)組。Linc01555的表達(dá)水平與臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理資料之間存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 Linc01555表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理資料的關(guān)系

2.3 2組結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖情況比較 分別于12、24、36 h時比較2組結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖情況，sh-Linc01555組(轉(zhuǎn)染過表達(dá)lncRNA Linc01555質(zhì)粒)增殖活力顯著高于sh-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖情況比較

2.4 2組結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡情況比較 sh-Linc01555組凋亡率顯著降低于sh-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖2。

圖2 sh-NC組、sh-Linc01555組患者結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡情況比較

表3 2組結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡情況比較

2.5 2組結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲情況比較 sh-Linc01555組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著高于sh-NC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲的比較

3 討論

結(jié)直腸癌是常見的胃腸道惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率較高，其早期沒有顯著的臨床表現(xiàn)，但隨著病情逐漸發(fā)展，患者隨之出現(xiàn)便秘、腹瀉、便中帶血等臨床表現(xiàn)，發(fā)展至晚期還會出現(xiàn)貧血、體重驟降等癥狀，這嚴(yán)重影響患者的生命安全和生活質(zhì)量，也給患者及其家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。長鏈非編碼RNA與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與促癌基因激活、抑癌基因失活密切相關(guān)，近年來，研究[9-10]發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRNA在腫瘤組織中異常表達(dá)，這提示其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位，它可能是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，也可能是抑制腫瘤增殖分化的重要因素，對于惡性腫瘤的診斷、治療及預(yù)后具有重要意義。相關(guān)研究[11]表明，長鏈非編碼RNA對結(jié)直腸癌具有顯著影響。本文旨在通過實驗觀察Linc01555對結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)特點及并分析其對結(jié)直腸癌增殖、遷移、侵襲的影響，試圖為結(jié)直腸癌的診斷、治療及預(yù)后提供新的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

lncRNA在多種癌癥組織中構(gòu)建了復(fù)雜又精密的調(diào)控體系，其表達(dá)失調(diào)能夠引起癌細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)，調(diào)控癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等。近些年來，全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)飛速發(fā)展，因此與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的長鏈非編碼RNA受到研究人員的廣泛關(guān)注。長鏈非編碼RNA與DNA、RNA及蛋白質(zhì)分子等之間存在相互作用的關(guān)系，它能夠調(diào)控染色質(zhì)構(gòu)型、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)并在其中扮演重要的角色，它還能影響腫瘤細(xì)胞的惡性表型，因此，越來越多的專家將其作為癌癥預(yù)后的標(biāo)志物進(jìn)行研究。相關(guān)研究[12]指出，長鏈非編碼RNA MALAT1可以調(diào)控AKAP9基因促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，并且MALAT1高表達(dá)可以促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的分裂和分化，并且其與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移、分化程度等還具有相關(guān)性。還有研究[13]表明，長鏈非編碼RNA HOTAIR促進(jìn)結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移時表達(dá)尤其顯著，其表達(dá)同樣與結(jié)直腸癌的浸潤深度、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移成正比。研究[14]表明，在人體的多種腫瘤組織中，長鏈非編碼RNA PEG10呈現(xiàn)異常高表達(dá)，而沉默長鏈非編碼RNA PEG10基因則能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活力及遷移和侵襲能力，這也提示長鏈非編碼RNA PEG10具有癌基因的功能。

前期我們運用生物信息學(xué)方法，對癌癥基因組圖譜計劃(the cancer genome atlas TCGA)數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌和癌旁正常組織信息進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)，并提取RNA seq的raw count表達(dá)值數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從中篩選出已知lncRNA表達(dá)值，并通過聚類分析及表達(dá)差異分析，繪制聚類圖，研究表明，Linc01555在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，這表明結(jié)直腸癌患者體內(nèi)Linc01555存在特異性表現(xiàn)，提示Linc01555可能是結(jié)直腸癌的診斷、治療及預(yù)后評估相關(guān)的新靶點。

為探索結(jié)直腸癌患者Linc01555水平與臨床病理資料的關(guān)系，我們又進(jìn)行了卡方檢驗，結(jié)果表明，Linc01555的表達(dá)水平與臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，臨床分期及病理分級高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者均伴有Linc01555高表達(dá)，這表明Linc01555高表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展也存在關(guān)系。這一研究結(jié)論與長鏈非編碼RNA PEG10在結(jié)直腸癌中的表現(xiàn)相類似，徐博文等[15]研究指出長鏈非編碼RNA PEG10與結(jié)直腸癌患者腫瘤浸潤深度、TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。

本研究還通過CCK-8實驗觀察結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖情況，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，sh-Linc01555組癌細(xì)胞的增殖活力顯著升高，表明sh-Linc01555能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖活力；研究中還通過流式細(xì)胞術(shù)測定了細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果表明，Linc01555過表達(dá)干擾后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡率降低，并且顯著低于sh-NC組，說明Linc01555可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡；Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，在sh-Linc01555的作用下，結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲也受到影響，出現(xiàn)明顯降低增加，這表明sh-Linc01555可以促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲，這提示我們或許可以通過負(fù)性調(diào)控Linc01555水平，即敲低Linc01555來抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，增加凋亡率。吳建龍等[10]研究指出，結(jié)直腸癌患者體內(nèi)長鏈非編碼RNA LINC00239也呈現(xiàn)高表達(dá)，其在實驗中敲低LINC00239水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力顯著下降，這也從側(cè)面提示調(diào)控Linc01555可能會影響結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，Linc01555在結(jié)直腸癌患者癌組織中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，并且Linc01555表達(dá)量與結(jié)直腸癌患者的臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理資料密切相關(guān)，另外，Linc01555干擾能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡，這表明Linc01555對結(jié)直腸癌的靶向治療及預(yù)后具有重要意義，可將Linc01555作為臨床治療結(jié)直腸癌的新型靶點。但本研究也存在一定的局限性，一方面，該研究納入的病例數(shù)不算多，且病例的來源相對單一，因此所獲得的實驗結(jié)果具備單一性，還應(yīng)增加病例數(shù)，擴(kuò)大病例來源進(jìn)行深入研究；另一方面，Linc01555在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的具體分子機(jī)制尚不明確，也需進(jìn)行進(jìn)一步實驗探索。