王 琨，韓 強，彭書華，彭溦雁，韓林妍△

（1.重慶市云陽縣人民醫(yī)院，重慶 404500；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶 400016）

正常人紅細(xì)胞的平均壽命為120 d，每天有2×1011個紅細(xì)胞被破壞和重新補充，幾乎無隨機破壞的紅細(xì)胞出現(xiàn)［1］。含有RGD序列［精氨酸（Arg）-甘氨酸（Gly）-天門冬氨酸（Asp）組成］的蛋白質(zhì)，以及作為其受體的整合素，構(gòu)成了細(xì)胞黏附的主要識別系統(tǒng)［2］。已有研究表明，巨噬細(xì)胞表面的αvβ3整合素和其他受體可介導(dǎo)凋亡細(xì)胞的吞噬［3］。在人紅細(xì)胞膜骨架中，血影蛋白α［4］，錨蛋白［5］和帶4.2蛋白［6-7］均位于細(xì)胞膜磷脂雙分子層內(nèi)，且均為含有RGD序列的主要膜骨架蛋白；錨蛋白常與帶3蛋白和帶4.2蛋白緊密結(jié)合，將骨架蛋白與質(zhì)膜緊密相連［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞膜骨架蛋白血影蛋白、錨蛋白和帶4.2蛋白中，僅錨蛋白與αvβ3整合素具有親和結(jié)合力，通過帶3蛋白基因敲除（帶3-/-）和帶4.2蛋白基因敲除（P4.2-/-）紅細(xì)胞，可研究蛋白外翻過程中的作用。帶3蛋白缺失的紅細(xì)胞具有正常水平的血影蛋白和帶4.1蛋白，其膜骨架的結(jié)構(gòu)接近正常狀態(tài)的紅細(xì)胞［4］。帶4.2-/-模型小鼠會出現(xiàn)輕度遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥［6］，但膜上含有正常數(shù)量的血影蛋白和錨蛋白，膜骨架結(jié)構(gòu)基本完好無損。通常認(rèn)為，帶3蛋白對紅細(xì)胞膜的生物合成和力學(xué)性能起關(guān)鍵作用。為了解錨蛋白的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，特別是RGD序列在其外翻中的作用，選取了錨蛋白敲除小鼠對缺乏錨蛋白調(diào)控結(jié)構(gòu)域的紅細(xì)胞進行研究。由于小鼠8號染色體上Ank-1基因的缺陷，錨蛋白基因敲除純合子型（nb/nb）紅細(xì)胞幾乎完全缺乏全長210 kDa的錨蛋白［7-10］。作為替代，出現(xiàn)了1種缺乏完整調(diào)控結(jié)構(gòu)域，但包括完整質(zhì)膜和血影蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的157 kDa nb-錨蛋白（p150）。nb/nb和帶3-/-紅細(xì)胞特性已被證明［5，11］，故可根據(jù)紅細(xì)胞特性鑒定小鼠的各個基因型。為此，本研究中對帶3蛋白、帶4.2蛋白和錨蛋白基因敲除的紅細(xì)胞表面錨蛋白、磷脂酰絲氨酸（PS）和巨噬細(xì)胞表面受體αvβ3整合素及PS受體的結(jié)合進行了考察?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：LBY-BX型紅細(xì)胞變形儀（北京普利生儀器有限公司，重復(fù)性誤差小于5%）；BX53型顯微鏡（日本Olympus公司）；FACScan型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

試藥：15%聚乙烯吡咯烷酮（PVP，美國Sigma公司，相對分子量40 kDa，批號為9003-39-8）；錨蛋白一抗、FITC偶聯(lián)二抗（美國Santa Cruz公司）；Annexin V-PE（藻紅蛋白標(biāo)記，美國BD公司）；RBC緩沖液（成都市科隆化學(xué)品有限公司，含20 mmol/L Na2HPO4，5 mmol/L KH2PO4，65 mmol/L NaCl和2.5 mmol/L CaCl2，pH7.4）；其余試劑均為分析純。

動物：實驗動物購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗室，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（渝）2018-0003；實驗動物使用許可證號SYXK（渝）2018-0003。實驗動物飼養(yǎng)符合規(guī)范，實驗涉及的動物操作均經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

紅細(xì)胞變形性和滲透脆性測定：實驗室自行構(gòu)建C57BL/6J野生型（+/+）、nb/nb、P4.2-/-和帶3-/-的小鼠各3對（4～6周齡，體質(zhì)量160～190 g）。帶3-/-為在雜交種屬（129/Sv-C57BL/6J）自交系的背景上獲得。將+/+、nb/nb、P4.2-/-和帶3-/-紅細(xì)胞與RBC緩沖液（分加或不加CaCl2兩種）500 g，37℃孵育。為制造剪切力，將樣品重懸于含15%PVP的RBC緩沖液中。將樣品（500μL）放入預(yù)熱至37℃的紅細(xì)胞變形儀中，1 000 s-1作用10 min。設(shè)定剪切速率為100～1 000 s-1（相當(dāng)于10.5～105 dyne/cm2），根據(jù)10個不同剪切速率下的指數(shù)計算綜合變形率指數(shù)；同時進行滲透壓脆性試驗，并以綜合伸長指數(shù)（integrated EI）與CaCl2溶液孵育時間作圖。采用綜合伸長指數(shù)分析紅細(xì)胞程序性死亡過程中紅細(xì)胞膜骨架的變形能力，以評估在一系列剪切力下紅細(xì)胞的總體變形能力?？疾旒t細(xì)胞在有或無剪切力作用下，與鈣離子孵育不同時間的變形能力，數(shù)值越大表明變形能力越強。

錨蛋白和PS外翻情況檢測：選取缺失帶3、帶4.2或錨蛋白調(diào)節(jié)域的突變紅細(xì)胞，檢測在上述情況下錨蛋白能否外翻到細(xì)胞表面，并將紅細(xì)胞暴露在2.5 mmol/L的CaCl2溶液中（無ATP供應(yīng)的生理狀態(tài)）以模擬生理條件。首先用含或不含2.5 mmol/L CaCl2的RBC緩沖液在37℃下孵育紅細(xì)胞1，2，4，8 h，采用紅細(xì)胞變形儀以1 000 s-1速率剪切作用10 min。紅細(xì)胞（106個）用4%多聚甲醛固定，不透膜，然后以一抗（1∶1 000）和二抗（1∶1 000）孵育。隨后，用膜聯(lián)蛋白Annexin V-PE孵育細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面PS外翻情況。

巨噬細(xì)胞對紅細(xì)胞的識別及黏附：取來自2～3月齡的雌性B6D2F1小鼠腹腔中的巨噬細(xì)胞（105個），黏附在觀察用的腔室上，孵育過夜，加入紅細(xì)胞（106個），顯微鏡下計數(shù)與巨噬細(xì)胞黏附的紅細(xì)胞數(shù)。平行操作3次。

1.3 方法學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 程序性死亡前突變紅細(xì)胞的變形性和滲透脆性

等滲溶液中、可變剪切力下紅細(xì)胞的變形曲線見圖1 A。結(jié)果表明，+/+紅細(xì)胞的綜合伸長指數(shù)最初最高，P4.2-/-紅細(xì)胞的最低。CaCl2溶液孵育后，4 h內(nèi)剪切力對帶3-/-、nb/nb和P4.2-/-紅細(xì)胞有顯著影響，對孵育時間較長（8 h）的+/+紅細(xì)胞影響不顯著。綜合分析，在細(xì)胞死亡過程中，綜合伸長指數(shù)最低的是P4.2-/-紅細(xì)胞，其次是nb/nb和帶3-/-。與+/+比較，nb/nb、帶3-/-和P4.2-/-紅細(xì)胞均有顯著差異（P＜0.000 1）。

滲透脆性試驗結(jié)果見圖1 B。可見，P4.2-/-紅細(xì)胞的滲透脆性在正常情況（孵育0 h時）下和鈣離子存在情況下孵育的每個試驗點均最弱。正常情況下，+/+、nb/nb和帶3-/-之間無顯著差異，但隨著孵育時間的延長，+/+紅細(xì)胞與突變紅細(xì)胞之間綜合伸長指數(shù)差異顯著。在每項試驗中，剪切力對紅細(xì)胞的滲透脆性也有一定影響。

2.2 錨蛋白在細(xì)胞程序性死亡過程中的外翻情況

結(jié)果見圖2。+/+紅細(xì)胞在無鈣離子存在時，孵育8 h時僅引起少量錨蛋白外翻，而在鈣離子與剪切力同時存在時則對錨蛋白外翻有一定影響；無論有無鈣離子存在，帶3蛋白缺失時，錨蛋白基本不發(fā)生外翻，剪切力和孵育時間也無明顯影響；在鈣離子存在時，剪切力作用更易加劇帶4.2-/-紅細(xì)胞中錨蛋白的外翻，但與nb/nb比較，其中錨蛋白的外翻程度降低；在不含鈣離子的nb/nb紅細(xì)胞中，剪切力對錨蛋白外翻仍有一定影響，較長的孵育時間也會導(dǎo)致更多的錨蛋白外翻；nb/nb紅細(xì)胞與2.5 mmol/L CaCl2孵育數(shù)小時，在無葡萄糖或其他能源供應(yīng)時，剪切力升高了外表面的錨蛋白水平。孵育1 h后，無剪切力作用也會導(dǎo)致錨蛋白的外翻，孵育時間較長時外翻更明顯。

2.3 PS在程序性死亡過程中的外翻情況

無鈣離子存在時，剪切力也會導(dǎo)致PS翻轉(zhuǎn)，且外翻隨著孵育時間的延長而增強。帶3-/-紅細(xì)胞的PS外翻相對較少，P4.2-/-紅細(xì)胞中PS外翻情況與+/+相似。有鈣離子存在時，剪切力作用可顯著增加nb/nb紅細(xì)胞表面PS的外翻。詳見圖3。

2.4 巨噬細(xì)胞對程序性死亡紅細(xì)胞的識別和黏附

nb/nb紅細(xì)胞的黏附數(shù)為+/+的4～6倍，P4.2-/-紅細(xì)胞的黏附數(shù)低于nb/nb，但高于帶3-/-。詳見圖4（縱坐標(biāo)指每100個巨噬細(xì)胞黏附的紅細(xì)胞數(shù)量）。

3 討論

血液中紅細(xì)胞并非隨時保持雙凹圓盤形，其常會被血液循環(huán)中的剪切力極大地扭曲，這種扭曲也是紅細(xì)胞能通過脾臟的基本要求。本研究中對突變紅細(xì)胞的力學(xué)特性進行了分析，以了解紅細(xì)胞膜蛋白在紅細(xì)胞膜骨架中的作用，從而了解紅細(xì)胞膜的變形性和滲透脆性。結(jié)果表明，正常紅細(xì)胞在細(xì)胞死亡前會逐漸喪失變形能力，突變紅細(xì)胞的變形能力和滲透脆性較正常紅細(xì)胞顯著降低。在這些條件下，紅細(xì)胞缺少帶3蛋白、錨蛋白或帶4.2蛋白可能使球狀紅細(xì)胞增多或膜表面積減小，表面積/體積降低并導(dǎo)致變形能力降低［11］。在這3種基因型中，P4.2-/-紅細(xì)胞的變形能力低于帶3-/-和nb/nb，這表明帶4.2蛋白在紅細(xì)胞膜骨架中起著重要作用。

本研究中采用3種基因敲除小鼠，研究了細(xì)胞程序性死亡時紅細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)和錨蛋白的外翻情況。nb/nb紅細(xì)胞僅有少量截短的錨蛋白種類，缺少帶3正常數(shù)量的蛋白4.2，但與+/+和其他相同條件下的突變紅細(xì)胞相比，nb/nb紅細(xì)胞中錨蛋白的外翻更明顯。本研究結(jié)果表明，截短的錨蛋白在受到鈣離子及剪切力作用時更易外翻，這意味著缺失部分或全部的調(diào)控結(jié)構(gòu)域可能是錨蛋白外翻的必要步驟。

帶3-/-紅細(xì)胞保留了50%的錨蛋白，但無帶3蛋白；P4.2-/-紅細(xì)胞具有正常數(shù)量的錨蛋白，但缺乏帶4.2蛋白。這兩種紅細(xì)胞的錨蛋白外翻數(shù)量基本一致，低于正常紅細(xì)胞，表明帶3蛋白、帶4.2蛋白的連接將錨蛋白固定在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)對膜蛋白的外翻非常重要。除了膜骨架，紅細(xì)胞的死亡機制還涉及PS。細(xì)胞程序性死亡過程中，帶負(fù)電荷的PS從內(nèi)葉轉(zhuǎn)移到外葉。PS的移位是由細(xì)胞內(nèi)鈣離子活性的增加觸發(fā)的，這一過程也激活了蛋白酶，如鈣蛋白酶，這是一種半胱氨酸內(nèi)肽酶，可降解錨蛋白和其他膜骨架蛋白。錨蛋白的外翻也可能攜帶一些PS，特別是考慮到等電點為8.95的帶4.2蛋白，可能已經(jīng)在膜蛋白復(fù)合體周圍吸引了大量的PS。

綜上所述，截短錨蛋白在生理濃度下與胞外鈣離子孵育時更易外翻到紅細(xì)胞表面，并隨剪切力作用增強；帶3蛋白，帶4.2蛋白的存在對于將錨蛋白固定在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)至關(guān)重要；而錨蛋白外翻的紅細(xì)胞更易被巨噬細(xì)胞黏附。因此，錨蛋白上外翻的RGD序列可能是衰老或患病紅細(xì)胞的潛在死亡信號。