孫坤坤 韓學(xué)超 孫娜 康壽明 徐琬梨

山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是由于絕經(jīng)后女性卵巢功能衰退進(jìn)而雌激素水平下降，從而導(dǎo)致骨吸收大于骨形成，出現(xiàn)低骨量和骨組織的顯微結(jié)構(gòu)退行性變，骨脆性和骨折易感性增加的一種全身代謝性疾病[1]，由PMOP引起的嚴(yán)重的醫(yī)療和社會(huì)負(fù)擔(dān)已成為全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。中醫(yī)方劑青娥丸為補(bǔ)腎強(qiáng)腰的代表方劑，臨床療效突出，但具體作用機(jī)制不明確，本研究綜合總結(jié)了近年來(lái)青娥丸治療PMOP的臨床應(yīng)用、活性成分和現(xiàn)代藥理機(jī)制，為研究該方治療PMOP的療效和機(jī)制提供了現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。在文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討青娥丸治療PMOP的潛在作用機(jī)制，為青娥丸治療PMOP臨床應(yīng)用提供新的思路。

1 青娥丸中主要中藥活性成分藥理研究

1.1 杜仲

杜仲是杜仲科植物杜仲的干燥樹(shù)皮，《神農(nóng)本草經(jīng)》言其“主腰脊痛，補(bǔ)中益精氣，堅(jiān)筋骨”。即具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨的功效。在中藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSP)中共發(fā)現(xiàn)172種化合物，包括杜仲苷、松脂醇二葡萄糖苷、黃酮類等化合物。在現(xiàn)代中藥研究與藥理學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)杜仲中桃葉珊瑚、槲皮素和京尼平苷在小鼠成骨細(xì)胞 MC3T3-E1 體外培養(yǎng)中可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化[2]；另有研究[3]顯示，咖啡酸、京尼平苷酸、黃芩苷和紫云英苷作為杜仲抗骨質(zhì)疏松的活性成分能夠提高成骨細(xì)胞分化，而且京尼平苷酸還可以抑制成骨細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)換，維持細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡。此外，趙亮等[4]通過(guò)鹽炙杜仲治療去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠發(fā)現(xiàn)杜仲可以改善血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，加速骨形成從而治療PMOP。

1.2 補(bǔ)骨脂

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂的干燥成熟果實(shí)，具有補(bǔ)腎助陽(yáng)的功效，可治療腎陽(yáng)不足引起的腰膝疼痛，同時(shí)在治療PMOP中療效突出。近年來(lái)隨著對(duì)補(bǔ)骨脂的研究不斷深入，已從補(bǔ)骨脂中分離出近百種化合物，主要包括香豆素類、黃酮類、單萜酚類。補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素是補(bǔ)骨脂的主要活性成分，兩者都具有雌激素樣作用，可作用于雌激素受體提高成骨細(xì)胞的分化與增殖，增加骨保護(hù)素的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的成熟與分化，從而減少骨質(zhì)損失[5-6]。另有文獻(xiàn)研究[7]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素不僅能通過(guò)激活 NF-κB 有絲分裂原刺激成骨細(xì)胞增殖，而且能增加卵巢切除骨質(zhì)疏松大鼠模型的骨量，此外，補(bǔ)骨脂中的補(bǔ)骨脂酚除了能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化外，還能提高骨質(zhì)疏松患者的骨密度促進(jìn)正常骨骼發(fā)育鈣化。

2 青娥丸在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥治療中的臨床應(yīng)用

青娥丸契合PMOP發(fā)病病機(jī)，在PMOP治療上療效顯著，近年來(lái)對(duì)于青娥丸治療PMOP的臨床研究日益增多。夏雪等[8]通過(guò)臨床觀察發(fā)現(xiàn)青娥丸能明顯改善PMOP患者臨床癥狀，減輕患者疼痛，增加骨密度，臨床用藥安全可靠、療效確切，可以有效防治PMOP。余海等[9]通過(guò)臨床研究報(bào)道青娥丸通過(guò)抑制破骨細(xì)胞活性來(lái)改善骨質(zhì)疏松，抑制骨吸收，降低骨橋蛋白水平，并可以長(zhǎng)期維持PMOP患者的骨密度，有效防治PMOP。陸思成等[10]對(duì)60例腎陽(yáng)虛型PMOP患者臨床觀察，結(jié)果顯示青娥丸可明顯改善癥狀，增強(qiáng)骨質(zhì)強(qiáng)度，減少骨折的發(fā)生。陳帆等[11]通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外治療PMOP文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析顯示，青娥丸的治療效果優(yōu)于西藥常規(guī)治療，能明顯緩解PMOP患者疼痛。另有多項(xiàng)臨床研究[12-13]報(bào)道了青娥丸對(duì)于治療腎虛血瘀型PMOP具有良好療效，可以明顯改善患者腰背疼痛和腰膝酸軟的癥狀，增加骨密度，提高患者生活質(zhì)量。

3 青娥丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥理機(jī)制

為了更好地了解青娥丸治療PMOP的作用機(jī)制，近年來(lái)在其藥理機(jī)制方面研究增多。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[14]表明，青娥丸有效改善PMOP大鼠異常骨代謝，防止骨量流失。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[15-16]證實(shí)，青娥丸含藥血清均能夠顯著提高人成骨細(xì)胞活性，從而刺激骨形成，抑制骨量流失，改善骨代謝，發(fā)揮防治PMOP的作用。

骨微循環(huán)與PMOP密切相關(guān)，骨量的減少總是伴隨著骨微血管在骨髓腔中的低灌注而發(fā)生，實(shí)驗(yàn)研究[17]證實(shí)青娥丸能提高大鼠股骨骨髓灌注參數(shù)以及血管內(nèi)皮標(biāo)志物血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelium growth factor，VEGF)表達(dá)水平從而改善骨微循環(huán)治療PMOP。TNF-α、IL-6是骨代謝過(guò)程中最常見(jiàn)且最重要的炎癥細(xì)胞因子，在介導(dǎo)PMOP患者骨吸收中發(fā)揮重要作用，有研究[18]指出青娥丸通過(guò)抑制TNF-α、IL-6的水平而抑制破骨細(xì)胞的增殖和分化，發(fā)揮治療PMOP的作用。

絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素水平明顯下降，低水平的雌激素會(huì)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路表達(dá)，從而影響骨代謝。β-catenin作為該信號(hào)通路中最關(guān)鍵的分子之一，能夠調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、增值和凋亡，同時(shí)β-catenin的過(guò)表達(dá)可增加Wnt信號(hào)的活性[19]。此外，有研究[20]發(fā)現(xiàn)β-catenin水平與RANKL/OPG比值呈顯著的負(fù)相關(guān)，RANKL/OPG比值增大引起骨代謝負(fù)平衡，在骨代謝系統(tǒng)中RANKL可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞進(jìn)一步分化、加速骨吸收；OPG一方面競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANK，另一方面促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收。實(shí)驗(yàn)研究[21]發(fā)現(xiàn)青娥丸能夠顯著提高患者血清β-catenin蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而恢復(fù)RANKL-RANK-OPG軸紊亂，減少骨量流失，提高患者骨密度從而有效發(fā)揮防治PMOP的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)青娥丸能提高血清中雌激素的水平，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究[22]表明雌激素可以提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS水平，改善細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮抗PMOP的作用。

4 青娥丸活性化合物在治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中的作用

中藥復(fù)方不是藥物的單純組合，而是多種有效成分的協(xié)同作用，為了解青娥丸的多組分治療系統(tǒng)如何對(duì)PMOP產(chǎn)生多重效應(yīng)，我們采用綜合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析青娥丸和PMOP中活性生物標(biāo)志物的共同靶標(biāo)。構(gòu)建這種方法是為了揭示青娥丸、靶蛋白和PMOP的活性標(biāo)志物之間的關(guān)系(圖1)。

圖1 青娥丸治療PMOP系統(tǒng)藥理學(xué)框架Fig.1 pharmacological framework of Qing’e pill in the treatment of PMOP system

經(jīng)過(guò)分析統(tǒng)計(jì)，除去沒(méi)有靶標(biāo)的化合物，在青娥丸中共找尋到37個(gè)化合物，其中杜仲30個(gè)、補(bǔ)骨脂5個(gè)、核桃仁2個(gè)、大蒜1個(gè)，將所有化合物靶標(biāo)去重后得到218個(gè)藥物靶標(biāo)。在DisGENET數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)PMOP疾病靶標(biāo)171，由于疾病靶標(biāo)過(guò)少，我們將171個(gè)靶標(biāo)映射到高質(zhì)量蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)HINT(High-quality INTeractomes)中，HINT數(shù)據(jù)庫(kù)[23]整合了8個(gè)蛋白-蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)HPRD、BioGrid、VisAnt、DIP、MIPS、IntAct、IRefWeb、MINT并通過(guò)高質(zhì)量篩選標(biāo)準(zhǔn)保留可靠性中高的數(shù)據(jù)，最后得到PMOP靶標(biāo)1 776個(gè)。本研究將青娥丸與PMOP靶標(biāo)取交集，最終獲得79個(gè)活性靶蛋白用于后續(xù)分析。整理“藥物-成分-靶標(biāo)”的相互對(duì)應(yīng)關(guān)系，并將其導(dǎo)入Cytoscape3.6.0軟件中，構(gòu)建青娥丸治療PMOP的網(wǎng)絡(luò)藥理圖(圖2)。

圖2 青娥丸組方活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Active component-target network diagram of Qing’e Pill prescription

對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，取Degree值前20個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中成分12個(gè)，靶點(diǎn)8個(gè)。杜仲成分槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、丁香黃素(Syringetin)、β-胡蘿卜素(beta-carotene)、(9R)-6′-甲氧基奎寧-9-胺三鹽酸鹽、三甲花翠苷(hirsutin_qt)、丙烯醇、咖啡酸(caffeic acid)，補(bǔ)骨脂成分豆甾醇(stigmasterol)，核桃仁成分鞣花酸(ellagic acid)，核桃仁和大蒜共有成分亞麻酸(linolenic acid)，可能通過(guò)作用于HSP90AA1、NCOA2、ADRB2、DPP4、AR、NOS2、ESR1、RXRA等關(guān)鍵蛋白干預(yù)了多個(gè)成骨、破骨、骨微循環(huán)等相關(guān)生物學(xué)過(guò)程，從而發(fā)揮對(duì)PMOP的治療作用。其中杜仲的相關(guān)成分槲皮素、山奈酚等與PMOP相關(guān)作用靶點(diǎn)連接密度較大，因此杜仲可以成為青娥丸治療PMOP的關(guān)鍵藥物。由此可見(jiàn)，青娥丸網(wǎng)絡(luò)中既存在一個(gè)化合物與多個(gè)靶蛋白的相互作用，也存在不同化合物作用于同一個(gè)靶標(biāo)的現(xiàn)象，表明了青娥丸的多成分、多靶標(biāo)、多通路的作用特點(diǎn)，初步闡釋了青娥丸補(bǔ)腎強(qiáng)骨的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

對(duì)青娥丸與PMOP共有的79個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行KEGG分析，從生物信號(hào)通路角度構(gòu)建“交集靶標(biāo)-信號(hào)通路”對(duì)應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖3)，篩選出15條重要信號(hào)通路，節(jié)點(diǎn)大小表示富集到靶標(biāo)的數(shù)量，紅色節(jié)點(diǎn)越大表示信號(hào)通路的顯著性越高，說(shuō)明該條信號(hào)通路的重要性越高。筆者推測(cè)青娥丸治療PMOP的作用機(jī)制可能與TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、破骨細(xì)胞分化(osteoclast differentiation)、Wnt信號(hào)通路(Wnt signaling pathway)、雌激素信號(hào)通路(estrogen signaling pathway)等多條信號(hào)通路有關(guān)。此外筆者使用Cytoscape軟件中cytoHubba插件對(duì)79個(gè)關(guān)鍵蛋白進(jìn)行分析，找尋關(guān)鍵蛋白與重要活性化合物進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，對(duì)接結(jié)果如圖4所示。

圖3 關(guān)鍵通路-核心靶標(biāo)圖Fig.3 Critical pathway-core target diagram

圖4 關(guān)鍵蛋白-重要活性化合物分子對(duì)接圖Fig.4 Key protein-important active compound molecular docking diagram

5 結(jié)論與展望

青娥丸作為中醫(yī)經(jīng)典方劑治療PMOP療效顯著。本文從成分、臨床和實(shí)驗(yàn)研究、藥理作用等方面系統(tǒng)綜述了青娥丸對(duì)PMOP的影響，經(jīng)KEGG通路富集分析與分子對(duì)接驗(yàn)證推測(cè)青娥丸在PMOP治療中有一定作用，青娥丸起源于宋代，到如今已廣泛應(yīng)用于治療PMOP。然而青娥丸的開(kāi)發(fā)仍存在一些挑戰(zhàn)，如缺乏毒理研究及更進(jìn)一步系統(tǒng)的活性成分研究，所以導(dǎo)致青娥丸中有些活性化合物可能被忽略。但是，生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、高通量測(cè)序、高效液相色譜等現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)將越來(lái)越有助于青娥丸治療PMOP的機(jī)制研究。因此，在青娥丸等中藥復(fù)方防治PMOP的研究工作中，筆者將繼續(xù)運(yùn)用先進(jìn)的方法與手段探討其有效成分與作用機(jī)制，堅(jiān)持中西醫(yī)并重，為深入研發(fā)治療PMOP的中藥復(fù)方新藥奠定基礎(chǔ)。