潘多濤，王旭東，史洪巖，修志龍

（1 沈陽化工大學信息工程學院，遼寧省化工過程控制技術(shù)重點實驗室，遼寧沈陽 110142； 2 大連理工大學生物工程學院，遼寧 大連 116024； 3 浙江工業(yè)大學藥學院，浙江杭州 310014）

引 言

1,3-丙二醇（PDO）是一種重要的化學品，廣泛應(yīng)用于化妝品及表面活性劑等，尤其是可用于合成可生物降解材料，如：聚對苯二甲酸丙二酯（PTT）、聚三亞甲基醚乙二醇和雜環(huán)化合物等[1]。目前，PDO可以通過化學合成或微生物發(fā)酵生產(chǎn)?；瘜W合成過程中存在的高溫高壓、高毒性試劑以及昂貴的催化劑等問題嚴重制約了PDO 的工業(yè)化生產(chǎn)。相比之下，以微生物發(fā)酵是一種更加溫和、低耗能、低成本以及更加環(huán)保的生產(chǎn)方式[2-3]。在可產(chǎn)PDO 的微生物中，肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）和丁酸梭菌（Clostridium butyricum）因具有較強的底物耐受性、較高轉(zhuǎn)化率等優(yōu)勢而備受關(guān)注[4-5]。然而，發(fā)酵過程中產(chǎn)物（包括副產(chǎn)物）的毒性和反饋抑制等均會影響微生物的生長和PDO 的產(chǎn)出，這導致最終PDO 含量相對較低，不利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高和生產(chǎn)規(guī)模的擴大[6-7]。由于底物、產(chǎn)物和其他因素之間的關(guān)系較為錯綜復雜，依靠常規(guī)實驗方法很難去深入探究背后的機理。相比之下，采用動力學建模對發(fā)酵系統(tǒng)進行機理分析是一種更高效的研究手段，可對目標過程進行有效預(yù)測及優(yōu)化，為實際生產(chǎn)過程提供理論指導[8-10]。

自從Zeng 等[11]提出動力學模型來描述C.butyricum和K.pneumoniae的生長過程后，多種動力學模型被用來描述對應(yīng)菌株的底物和能量消耗、產(chǎn)物形成以及其他因素的影響關(guān)系[12-13]。進一步地，利用數(shù)學模型優(yōu)化K. pneumoniae發(fā)酵甘油生產(chǎn)PDO方面已經(jīng)有不少的研究工作[14-19]，如：Wang 等[20]基于調(diào)整結(jié)構(gòu)的模型，分析了甘油發(fā)酵過程的振蕩特性，利用Hopf 奇點約束優(yōu)化了操作條件；Zhu 等[16]、Kaur 等[21]分別利用動力學模型研究C. butyricum和Clostridium diolis的最佳培養(yǎng)條件，并優(yōu)化營養(yǎng)底物補料策略以獲得較高產(chǎn)量。除此之外，Ye 等[22]、Yang 等[23]利用混雜系統(tǒng)描述批式流加過程，研究了優(yōu)化控制算法。然而，這些工作主要集中在對模型的分析和潛力的挖掘上，對發(fā)酵過程的自動化控制理論方面的研究仍然比較缺乏。而在流程工業(yè)智能自動化的背景下，PDO 生物發(fā)酵過程的自動化控制顯得尤為重要[9,24-25]。

基于此，本文以K.pneumoniae連續(xù)發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇過程為研究對象，首先對發(fā)酵體系的多穩(wěn)態(tài)特性進行考察，分析連續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)定性；在此基礎(chǔ)上，設(shè)計了一種新型的發(fā)酵稀釋率反饋控制系統(tǒng)，以期為PDO 自動化生產(chǎn)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 方 法

1.1 模型的來源

K. pneumoniae連續(xù)發(fā)酵模型源于前期研究[17]。該模型主要描述了甘油發(fā)酵轉(zhuǎn)化為PDO 的動力學過程，包括主要代謝物的合成與分解之間的關(guān)系，對應(yīng)的數(shù)學描述如下：

其中，X為生物量，g·L-1；D為稀釋速率，h-1；CS0、CS分別為發(fā)酵過程中甘油的初始濃度和實時濃度，mmol·L-1；qS為 甘 油 的 比 消 耗 速 率，mmol·g-1·h-1；CPi為細胞外主要產(chǎn)物PDO、乙醇和乙酸的濃度，mmol·L-1；qi為上述三種胞外產(chǎn)物的比生成速率，mmol·g-1·h-1。模型中的參數(shù)列于表1[15]。

1.2 穩(wěn)態(tài)分析

微生物發(fā)酵過程中影響穩(wěn)態(tài)的因素可通過模型中特定參數(shù)的變化反映出來[26]。參數(shù)變化導致的系統(tǒng)狀態(tài)發(fā)生躍遷的現(xiàn)象稱為分支[27]，穩(wěn)態(tài)解的分支與平衡的穩(wěn)定性密切相關(guān)[28]。通過分支分析，能夠分析非線性系統(tǒng)中參數(shù)對狀態(tài)穩(wěn)定性的影響。本文采用函數(shù)連續(xù)性分析工具[29]進行模型多穩(wěn)態(tài)分析。

1.3 控制策略

在已報道的模型分析研究中，連續(xù)發(fā)酵過程的稀釋速率通常取固定值[15,20]。稀釋速率較高時，底物甘油流加速率較高，反應(yīng)器中殘余甘油量相對較多，這會導致大量殘余甘油以等速率流出發(fā)酵罐，不但造成極大的浪費，還會影響后續(xù)產(chǎn)物的分離過程；而稀釋速率較低時，甘油在發(fā)酵罐中的駐留時間增大，這能夠使甘油得到比較充分的轉(zhuǎn)化，但總體的生產(chǎn)強度較低?？梢姡♂屗俾蕦ιa(chǎn)性能和底物利用率有較大影響。因此，在現(xiàn)有模型[式(1)]的基礎(chǔ)上，增加對稀釋速率D的反饋控制，如式(2)所示。

式中，D0為基準參考稀釋速率，h-1；β為稀釋速率的調(diào)節(jié)增益系數(shù)；CeS為期望的殘余甘油濃度，mmol·L-1；CePDO為期望的產(chǎn)物PDO 濃度，mmol·L-1；為期望的產(chǎn)物乙醇濃度，mmol·L-1；w1和w2為稀釋速率調(diào)節(jié)項的權(quán)重占比；T是單位時間，取固定值1 h。

式(2)中的調(diào)節(jié)項會根據(jù)發(fā)酵系統(tǒng)中殘余甘油或產(chǎn)物濃度的高低來反饋動態(tài)調(diào)整稀釋速率D：殘余甘油CS的增加會負向調(diào)節(jié)D（減少甘油的流加量），而產(chǎn)物濃度CPDO和CEtOH的增加則會正向調(diào)節(jié)D。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程的穩(wěn)態(tài)分析

在先前的研究中，發(fā)現(xiàn)K.pneumoniae的連續(xù)發(fā)酵過程具有強非線性特性，存在多穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象[17,30]，而且，在相同的操作條件下存在兩種不同的穩(wěn)定狀態(tài)，這種現(xiàn)象不僅與操作條件有關(guān)，而且與操作模式有關(guān)。例如，在較高稀釋率和較高底物濃度的條件下，底物濃度從低變高或由高到低減小將導致多穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象的出現(xiàn)。這種多穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象不但在實驗中能夠觀察到[31-32]，而且還可通過對模型式(1)的連續(xù)性分析得到印證。因此，在前期工作基礎(chǔ)上，進一步通過雙因素分支分析探究多穩(wěn)態(tài)發(fā)生的臨界區(qū)域，結(jié)果見圖1。

圖1(a)～(e)中的點線、虛線和點劃線分別表示稀釋速率D取0.035、0.1 和0.26 h-1時反應(yīng)物在不同初始甘油濃度下的穩(wěn)態(tài)值變化趨勢。同時，圖中給出了D取0.1 h-1時不同初始甘油濃度下的反應(yīng)物濃度實驗值[圖1(a)～(e)中三角形標記]。圖中圓形標記表示出現(xiàn)多穩(wěn)態(tài)時的極限分支點（limit point），任取其中一個極限點進行稀釋速率和初始甘油濃度雙因素的分支分析，會得到一個閉合曲線[圖1(a)～(e)中實線]，該閉環(huán)會穿過不同稀釋率下獲得的各個極限點，參數(shù)的正向和負向變化結(jié)果交匯于尖點分支[cusp point，圖1(a)～(e)中方形標記]，尖點是狀態(tài)變化曲線中的一種奇異點，曲線上的點在移動到尖點時將會朝相反的方向移動。

圖1(a)～(e)的結(jié)果顯示，在特定的稀釋速率下（如D= 0.1 h-1），穩(wěn)態(tài)曲線都會經(jīng)過兩個極限分支點，兩個極限點之間的區(qū)域不穩(wěn)定，而兩個極限點之外的區(qū)域穩(wěn)定，表現(xiàn)為典型的雙穩(wěn)現(xiàn)象（bistable）[33]。此外，當稀釋速率逐步增大時，穩(wěn)態(tài)的不穩(wěn)定區(qū)域會漸漸收縮，伴隨著的是兩個極限點會逐漸重合為一個并與尖點重合，最終多穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象會消失（如D=0.26 h-1）；反之，稀釋速率的減小同樣會使不穩(wěn)定性區(qū)域收窄（如D=0.035 h-1）。總體上講，在初期隨著連續(xù)補料中甘油濃度的提高，生物量和（副）產(chǎn)物濃度均明顯上升，直至底物甘油過量[如圖1(c)中的拐點附近]。當甘油濃度持續(xù)增加時，殘余甘油會迅速上升，此時生物量和乙酸濃度快速降低，相較而言PDO 和乙醇的濃度則相對緩慢地減小，直至接近0（過量的底物完全抑制了反應(yīng)）。

圖1 發(fā)酵過程中不同稀釋速率下的多穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象及其臨界區(qū)域Fig.1 Multistability phenomenon and its critical region at different dilution rates during fermentation

生物代謝過程中的多穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象在大腸桿菌和酵母中均有一些報道[34-36]，其中底物抑制是其中的重要因素[37-38]。因此，推測K. pneumoniae的多穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象也與底物抑制[式(1)中的比生長速率]有關(guān)，可能原因是甘油作為單一底物在低濃度時扮演酶激活劑的角色，而在高濃度時則可能抑制酶促反應(yīng)。當體系中的底物濃度從低到高時，細胞內(nèi)的酶就會被激活從而激勵產(chǎn)物的生成，而隨著底物的進一步提高，則會超過酶的耐受閾值轉(zhuǎn)而成為抑制劑，此時酶促反應(yīng)會被抑制，殘余底物濃度會提高而產(chǎn)物則會相應(yīng)降低；另一方面，若底物濃度從高到低，胞內(nèi)酶會被抑制較長一段時間，酶的活性較低，因此底物的消耗和產(chǎn)物的形成較少[17,30,32]。由于多穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象會對生產(chǎn)產(chǎn)生不利影響，在實際發(fā)酵過程中，工作點的選取應(yīng)盡量避開多穩(wěn)態(tài)的臨界區(qū)域[20]。

2.2 發(fā)酵過程的優(yōu)化控制

發(fā)酵生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種自身的性能，而且還受限于發(fā)酵條件和工藝等因素。本文采用的數(shù)學模型已經(jīng)過大量研究驗證了其可靠性，并在先前的工作中利用集成建模（ensemble modeling）方法進行了發(fā)酵過程的操作條件優(yōu)化，獲得了最優(yōu)的初始甘油濃度和稀釋速率[15]。然而，在以往的實驗或模擬計算中，通常選取一個恒定的稀釋速率進行研究分析，具有一定的局限性。本文在前述多穩(wěn)態(tài)分析的基礎(chǔ)上，考慮了底物甘油和產(chǎn)物PDO 的反饋控制策略，使得實際的稀釋速率可隨底物和產(chǎn)物的濃度動態(tài)調(diào)整。根據(jù)圖1(f)中稀釋速率和初始甘油濃度的臨界區(qū)域（避開多穩(wěn)態(tài)區(qū)域），并結(jié)合前期工作[15]中集成建模優(yōu)化結(jié)果，設(shè)定初始甘油濃度CS0=780 mmol·L-1；在建立的稀釋速率反饋控制方程[式(2)]中，基準稀釋速率D0取0.23 h-1；期望的PDO穩(wěn)態(tài)濃度為CePDO=421 mmol·L-1，期望的殘余甘油濃度 為CeS= 25 mmol·L-1，期 望 的 乙 醇 穩(wěn) 態(tài) 濃 度 為= 50 mmol·L-1；甘油調(diào)節(jié)項的權(quán)重w1取0.1，PDO調(diào)節(jié)項的權(quán)重w2取0.8，而稀釋速率的調(diào)節(jié)增益系數(shù)β取0.15。經(jīng)控制的優(yōu)化計算結(jié)果如圖2、表2所示。

圖2 不同稀釋速率策略下的模擬結(jié)果對比Fig.2 Comparison of simulation results under different strategies for dilution rate

從表2 中的穩(wěn)態(tài)數(shù)據(jù)可以看出，產(chǎn)物PDO 的濃度提高了約20%，這大大提高了甘油的轉(zhuǎn)化率（由原來的0.478 mmol·mmol-1提高至0.563 mmol·mmol-1）；相對而言，殘余甘油的濃度反而提高，仔細分析穩(wěn)態(tài)數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，在未控制稀釋速率的情況下，雖然甘油的殘余量較低，但對產(chǎn)物PDO 生成的貢獻是有限的，有相當比例的甘油轉(zhuǎn)化為乙醇和乙酸。在施加控制手段后，代謝過程向有利于主產(chǎn)物形成的方向推進，穩(wěn)態(tài)情況下乙醇的濃度下降超過30%，乙酸的濃度也有小幅下降。綜合來看，在以恒定稀釋速率培養(yǎng)時，發(fā)酵過程的生產(chǎn)強度為85.70 mmol·L-1·h-1，應(yīng)用稀釋速率控制策略后，生產(chǎn)強度達到101.10 mmol·L-1·h-1，極大地提高了發(fā)酵性能。

表2 不同稀釋速率策略下的穩(wěn)態(tài)值對比Table 2 Comparison of steady values of metabolites under different strategies for dilution rate

另一方面，稀釋速率反饋控制策略極大地縮短了發(fā)酵體系達到穩(wěn)態(tài)的時間，這在控制理論中被稱為“調(diào)整時間”（settling time），是系統(tǒng)動態(tài)性能的綜合指標。調(diào)整時間的縮短，意味著發(fā)酵系統(tǒng)能夠更快速地進入穩(wěn)態(tài)，提高整體的培養(yǎng)性能。在固定稀釋速率的情況下，甘油以恒定速率（即D）被輸入到反應(yīng)器中，但發(fā)酵初期，生物量有限，轉(zhuǎn)化的甘油也極為有限，此時大量的殘余甘油被排出反應(yīng)器，造成極大的浪費。如圖3所示，在采用反饋控制策略后，稀釋速率是動態(tài)變化的。在發(fā)酵初期，稀釋速率從較小值開始提高，甘油隨著稀釋速率的調(diào)整，逐步提高流加量，這與反應(yīng)器中微生物的增殖趨勢是一致的。在這個階段，甘油流加量的變化是與微生物的轉(zhuǎn)化能力匹配的，也就是“按需分配”甘油。同時由于稀釋速率不高，流出的發(fā)酵液的體積有限。從圖2還可以看出，反饋控制使得調(diào)整時間由原來的81.27 h縮短到了34.11 h（幅度超過50%），避免了30多小時的甘油損耗，有利于提高發(fā)酵性能。此外，采用恒定稀釋速率的發(fā)酵過程，其超調(diào)量較大，施加控制手段后，超調(diào)量明顯減小，同樣有利于提高發(fā)酵性能。

圖3 受控稀釋速率的變化過程Fig.3 Variation of the controlled dilution rate during the fermentation

3 結(jié) 論

提出了一種K. pneumoniae連續(xù)發(fā)酵甘油生產(chǎn)PDO 的自動化控制策略。首先通過數(shù)學函數(shù)連續(xù)性分析工具預(yù)測了該過程的多穩(wěn)態(tài)特性，結(jié)果表明在不同的初始甘油濃度或稀釋速率下，系統(tǒng)均會出現(xiàn)多穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象，通過雙因素分析，獲得了多穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)的臨界區(qū)域，該區(qū)域內(nèi)部的穩(wěn)態(tài)是不穩(wěn)定的，在實踐操作中可以依此選擇合適的工作點。在此基礎(chǔ)上，基于反饋控制理論，設(shè)計優(yōu)化了受殘余甘油和產(chǎn)物PDO 及乙醇濃度影響的稀釋速率反饋控制策略，該策略可作為實踐中連續(xù)培養(yǎng)的進料方案，經(jīng)自動控制的稀釋速率在提高產(chǎn)物濃度的同時，極大地縮短了系統(tǒng)達到穩(wěn)定的調(diào)整時間，可大幅度降低發(fā)酵初期階段甘油的浪費，提高了發(fā)酵過程的甘油的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度。