郭文陽，張宗源，潘夢詩，周留柱，亓蘭達，徐宏光，張英濤

（河南省科學院生物研究所有限責任公司，鄭州 450008）

近年來人們越發(fā)重視安全健康的生活環(huán)境，預防日常生活中各種致病微生物的侵擾，以致消毒劑的使用和需求量與日俱增，抗菌消毒技術也在加速發(fā)展［1］.目前殺菌消毒劑仍然以有機和無機殺菌劑為主，其中以金屬納米材料為主要成分的無機殺菌劑是研究熱點之一［2］.金屬納米材料一般指粒徑尺寸在1～100 nm之間的材料，因其顆粒小，比表面積大，常常表現(xiàn)出獨特的量子尺寸效應和表面效應，不同于普通的金屬物質［3-4］.特別是納米銀材料，因其獨特的物理化學性質和優(yōu)異的抗菌性能，被廣泛應用于電子、光學、生化、航天和醫(yī)藥等眾多領域［5］.目前納米銀的制備方法主要分為化學法、物理法和生物法.其中，化學法是利用還原劑將銀離子還原生成納米銀粒子，因其合成過程迅速，粒徑大小可控，并且可大量制備，成為制備納米銀的主流方法［6-7］.但是化學法需要用到一些有毒有害的試劑，比如檸檬酸鈉、乙二醇、硼氫化鈉等，往往會對環(huán)境安全和人體健康造成一定的威脅，不利于可持續(xù)發(fā)展.物理法主要包括真空氣體冷凝法、高壓磁控濺射法、激光燒蝕法和機械研磨法，這些方法對儀器的性能要求都比較高，制備條件苛刻、成本高，不利于大規(guī)模生產(chǎn).目前新興的、符合可持續(xù)發(fā)展的生物法逐漸成為制備納米銀的研究熱點.生物法制備納米銀是利用生物中存在的某些物質或者在其生長代謝過程中分泌、轉化得到的成分，與金屬鹽溶液反應得到金屬納米粒子，其中包括植物類、微生物類、藻類、碳水化合物、生物類聚合物等［4，8］.有研究表明植物類浸提物［9-11］、水果浸提物［12-13］等物質都含有許多具有還原性和穩(wěn)定性的化學成分，可作為還原劑將Ag+轉化為納米銀，得到納米銀的粒徑大概在5～60 nm之間，并且這些成分還能對制備的納米銀粒子形成覆蓋隔離的效果，以減少粒子間的團聚［14-15］.浸提法制備納米銀的反應過程比較快，但需要用到各種萃取劑和提取液，對溫度要求比較高，工藝復雜.而基于微生物介導的方法制備納米銀具有綠色環(huán)保、成本低廉、工藝簡單等優(yōu)勢，此方法合成的納米銀產(chǎn)品必將具有更大的市場潛力［16］.

納米銀粒子的抗菌性隨粒徑的減小而增強，以納米銀為主要成分的消毒劑一直在被研究和推廣，相對于酒精、過氧化氫、含氯消毒劑等物質，它安全、無刺激性氣味、具有廣譜的殺菌性、藥效持久，并且不易于產(chǎn)生耐藥性.目前報道的通過一些微生物合成納米銀的研究有很多［18-19］，并取得了相應進展，但有效制備納米銀的菌種有很大的局限性，并且制備的納米銀粒徑較大，抗菌作用不夠突出.本研究利用已篩選的一種真菌黑曲霉HQ-1，可以簡易快捷、低成本地制備小粒徑納米銀，并具有良好的抑菌活性，可為納米銀抗菌材料的發(fā)展提供理論依據(jù).

1 實驗

1.1 實驗材料

黑曲霉菌（Aspergillus niger）：從河南省鄭州市金水區(qū)東風渠河道土中篩選得到，經(jīng)AgNO3馴化后將其命名為HQ-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCC No.22415.

大腸桿菌和金黃色葡萄球菌：來源于河南省科學院生物研究所有限責任公司.

AgNO3：分析純，購買自鄭州派尼化學試劑廠.

PDA和PDB培養(yǎng)基：購買自北京奧博星生物技術有限責任公司，pH 7.2±0.2.

實驗用水全部為去離子水.

1.2 實驗設計

將土樣中篩選的菌株用含有AgNO3的PDB培養(yǎng)基，在30℃、180 r/min條件下，馴化培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)基中AgNO3的濃度依次為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L（以下mol/L記作M），挑選含5.0 mM AgNO3的培養(yǎng)基培養(yǎng)后的耐銀菌株，經(jīng)微生物菌種鑒定為黑曲霉菌（見下文2.1）.取馴化篩選得到的黑曲霉HQ-1接種到PDA培養(yǎng)基，待菌絲長滿培養(yǎng)基表面，然后進行傳代培養(yǎng)，確保菌株的生長活性.菌株接入100 mL PDB液體培養(yǎng)基，置于30℃、150 r/min的恒溫搖床保持3 d，之后過濾得到菌絲體；然后用無菌蒸餾水清洗4次，除去培養(yǎng)基成分，將濾得的菌絲體加入100 mL無菌蒸餾水中重懸，同樣條件下培養(yǎng)1 d，之后再次過濾得到二次發(fā)酵濾液.取100 mL濾液于250 mL的錐形瓶中，添加1.0 mL的AgNO3溶液（100 mM），放入25℃的恒溫培養(yǎng)箱中反應1 d，分別在正常（不做光照處理）和光照的條件下進行合成納米銀的實驗.同時取100 mL黑曲霉的二次發(fā)酵濾液，不添加AgNO3溶液，作為實驗的空白對照組.對制備的納米銀溶液進行表征分析，通過溶液的紫外吸收峰強度、電鏡圖、Zeta電位值以及溶液中顆粒的形貌、大小、分布情況等參數(shù)，分析納米銀的生成情況.最后應用牛津杯法分析本研究實驗制備的納米銀對常規(guī)致病菌（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）的抑菌效果.

1.3 樣品性能及表征

對實驗用的HQ-1菌送到深圳微生太科技有限公司進行鑒定，得到HQ-1的基因序列，將序列文件與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，得到與HQ-1序列相似性最大的物種信息.將制備的納米銀溶液混合均勻，用移液器吸取2.5 μL，利用超微量紫外可見分光光度計（Nanodrop 2000）對制備的納米銀溶液進行紫外掃描檢測，根據(jù)紫外吸收峰的出峰情況，判斷納米銀的生成效果.溶液中納米銀的形貌特征用鎢燈絲透射電鏡（JEM-1200EX）觀察，制樣觀察流程為：首先對納米銀溶液樣品做稀釋和超聲處理；然后將封口膜平鋪在玻璃片上，用鑷子把銅網(wǎng)夾放在封口膜上，用移液槍吸取10 μL樣品滴在銅網(wǎng)上，等待10 min之后用小片濾紙將多余液體吸走；最后計時60 min，待銅網(wǎng)自然晾干之后放在透射電鏡樣品臺上觀察.溶液中納米銀粒徑大小和Zeta電位值利用馬爾文激光粒度儀（Zetasizer Nano ZS90）測量，其步驟為：取約2.0 mg樣品，加至有1.0 mL純水的樣品池中，超聲震蕩5 min，使樣品完全分散，進行測量.納米銀對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果采用牛津杯法，通過觀察抑菌圈大小進行實驗.

本研究的整體實驗及相關分析流程如圖1所示.

圖1 實驗流程Fig.1 Flow diagram of experiment

2 結果與討論

2.1 黑曲霉HQ-1的鑒定

對實驗篩選的HQ-1菌序列，在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進行比對，根據(jù)得到的結果，利用MEGA-X軟件制作系統(tǒng)進化樹，得到結果如圖2所示.可明確看出，與測試物種HQ-1序列相似性最大的物種為黑曲霉（Aspergillus nigerATCC 16888），并且根據(jù)NCBI中比對的結果，兩者的序列相似性達到了99.8%，基本可以確定本實驗篩選的HQ-1為黑曲霉菌屬.

圖2HQ-1系統(tǒng)進化樹Fig.2 HQ-1 phylogenetic tree

2.2 紫外全波長掃描（UV-Vis）

眾所周知，納米銀溶液是一種相對穩(wěn)定的膠體體系，在掃描波長為410～440 nm之間能出現(xiàn)明顯的特征吸收峰.對本實驗條件下制備的納米銀溶液，利用超微量紫外分光光度計進行全波長掃描，得到光譜圖的結果如圖3、圖4所示.從圖3中可以看出，合成進行1 d之后，正常組的反應液在420～440 nm波長之間，并未出現(xiàn)明顯的紫外吸收峰，意味著溶液中未有納米銀生成；然而在同樣的波段間，光照組的反應液出現(xiàn)了特別明顯的紫外吸收峰，初步說明溶液中生成了納米銀，這與前人的研究成果相一致［20-21］.另有研究表明，微生物生長代謝之后的發(fā)酵液中存在還原性酶之類的物質，可以使溶液中的金屬離子被還原［22-23］.推測黑曲霉在發(fā)酵過程中也有還原性的物質產(chǎn)生，在光照的條件下，可以使Ag+被還原成小顆粒的銀單質形成納米銀溶液，或許這是反應液能合成納米銀的主要原因.圖4反映的是光照條件下納米銀溶液反應1 d、20 d、40 d的紫外吸收情況，從中可以看出，隨著反應時間的增加，光照條件下制備納米銀溶液的紫外吸收峰強度并未降低，反而有小幅度的上升，說明溶液中納米銀濃度有所增加；其最大吸收峰的位置沒發(fā)生紅移或藍移，意味著納米銀粒徑未發(fā)生變化，整體納米銀溶液一直比較穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯聚沉現(xiàn)象.因此，由以上結果可看出，光照條件下利用黑曲霉HQ-1能快速合成納米銀，并且穩(wěn)定性良好.另外需要指出的是，反應溶液的紫外吸收圖譜并非光滑的曲線，分析可能是由于黑曲霉HQ-1發(fā)酵液中存在一些蛋白、多糖、脂肪酸之類的物質影響了紫外可見分光度計入射光的平穩(wěn)吸收所導致.對此，后續(xù)研究將進一步優(yōu)化實驗方案，盡可能降低發(fā)酵液導致的不利影響.

圖3 納米銀溶液的紫外吸收光譜圖Fig.3 Ultraviolet absorption spectra of nano-silver solution

圖4 光照下納米銀溶液的紫外吸收光譜圖Fig.4 Ultraviolet absorption spectra of nano-silver solution under light

2.3 透射電子顯微鏡（TEM）觀察

目前制備納米銀的方法多樣，通過不同實驗方法制備的納米銀粒子大小和結構各有不同，比如已報道的納米銀有球形［24］、管柱形［25-26］、塊狀［27-28］、線形［29］、錐型［30］等形貌，納米銀的形貌特征、尺寸大小與反應介質和添加AgNO3的濃度有很大關系［31］.本研究使用分辨率大約為1.0 nm的透射電子顯微鏡對光照條件下制備的納米銀溶液進行觀察，分析反應溶液中納米銀的形貌、分散情況，評估粒徑大小，得到透射電鏡的結果如圖5所示.

圖5 納米銀溶液的透射電鏡圖Fig.5 TEM image of nano-silver solution

從圖5中可以看出，不管是在200 nm還是50 nm的尺度下觀察，納米銀粒子在溶液中是分散開來的、表面光滑的圓球形顆粒，僅有少量聚集，直觀來看顆粒大小均在20 nm以下.納米銀粒子在反應溶液中分布相對較均勻，沒有出現(xiàn)大量團聚的情況，能夠穩(wěn)定存在.

2.4 粒徑大小分析

利用馬爾文激光粒度儀測量光照條件下制備納米銀的動態(tài)光散射（DLS）粒徑，根據(jù)統(tǒng)計結果，繪制得納米銀顆粒的體積分布如圖6所示.納米銀顆粒尺寸主要集中在10 nm以下，很少部分出現(xiàn)在10～100 nm之間.同樣的，從餅狀圖中的統(tǒng)計結果可以看出，制備納米銀的粒徑范圍很窄，主要集中在3～10 nm之間，占比高達93.4%，粒徑大小在10～100 nm之間的納米銀顆粒體積占比約為6.0%，其余大于100 nm的顆粒僅占比0.6%.根據(jù)已知的研究結果，利用納米銀作為殺菌劑有效成分，其粒徑越小，殺菌效果越好.本實驗制備的納米銀粒徑分布集中，有很大的抗拒優(yōu)勢.另外，在同等條件下，將納米銀粒徑做到10 nm以下的研究成果并不多見，表明利用黑曲霉HQ-1發(fā)酵液制備納米銀粒子的方法，有很大的可行性和研究價值.

圖6 納米銀粒子的體積分布圖Fig.6 Volume distribution of nano-silver

2.5 Zeta電位分析

眾所周知，膠體溶液中分散粒子的表面都帶有一定的電荷，彼此間會相互排斥和吸引，以致最終會形成一個相對平衡的狀態(tài)，使得溶液體系穩(wěn)定存在.Zeta電位可用來評價微粒分散體系的物理穩(wěn)定性，是對顆粒之間相互排斥或吸引力強度的度量.一般Zeta電位絕對值越高，溶液中粒子間的靜電斥力越大，其物理穩(wěn)定性也就越好.基于此，對光照條件下制備的納米銀溶液測量Zeta電位值，得到的結果如圖7所示.從圖7中可以明顯看出，納米銀溶液的Zeta電位值在-50～-20 mV之間，電勢的峰值體現(xiàn)在-30.5 mV的位置，其電位絕對值整體高于20 mV，以此說明本方法制備的納米銀粒子在溶液中的靜電斥力較大，分散體系有良好的物理穩(wěn)定性.

圖7 納米銀溶液的Zeta電位圖Fig.7 Zeta potential diagram of nano-silver solution

2.6 納米銀的抑菌性分析

選取實驗室保藏的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌兩種常規(guī)致病菌，各自接種后，在37℃、150 r/min恒溫的條件下培養(yǎng)2 d，得到菌懸液，經(jīng)梯度稀釋、涂板、測定，可知大腸桿菌的濃度為4.0×108CFU/mL，金黃色葡萄球菌的濃度為7.0×108CFU/mL.分別取200 μL菌懸液均勻涂布到LB培養(yǎng)基上，之后在培養(yǎng)基上放置3個無菌牛津杯，然后各取200 μL在光照條件下制備的納米銀溶液、空白發(fā)酵液和1.0 mM AgNO3溶液做對比，加入牛津杯中，分析制備的納米銀溶液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果.扣除空白發(fā)酵液的抑菌影響，根據(jù)抑菌圈大小作圖，得到的實驗結果如圖8所示.從圖8中可知，AgNO3和納米銀對大腸桿菌的抑菌圈平均直徑分別為16.2 mm和14.8 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑分別為16.8 mm和15.3 mm.兩者對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果比較接近，但整體以AgNO3的抑菌效果略占優(yōu)勢，此結果與楊婧等［32］的研究結論相一致.然而，AgNO3產(chǎn)品在市場上不允許流通，將其作為消毒產(chǎn)品有很大的局限性，所以納米銀在抑菌材料方面有很大的應用潛力.已有研究表明：納米銀粒子的粒徑越小，其抗菌作用越強，并且隨著粒徑的減小，其抗菌的類型也更加廣泛，進而表現(xiàn)出廣譜的抗菌性［17，33］；納米銀的粒徑越小，比表面積越大，進而釋放銀離子的效果越強烈.因此，分析納米銀粒子產(chǎn)生抑菌性的原因可能是：一方面是粒徑較小的納米銀可以透過細胞膜，阻礙細胞代謝和分裂，從而加速細胞的死亡［34］；另一方面是Ag+帶有較強的正電荷，更易于和微生物表面的負電荷結合，進而溶解細胞膜、改變細胞的通透性、抑制細菌脫氫酶的活性，破壞細胞DNA的結構，最終達到殺滅微生物的目的［35］.

圖8 抑菌實驗結果Fig.8 Bacteriostatic test results

3 結論

本實驗初步探究了篩選、馴化的黑曲霉HQ-1的發(fā)酵濾液與AgNO3反應制備納米銀粒子的情況.經(jīng)過一系列的表征和分析，發(fā)現(xiàn)在光照條件下，黑曲霉HQ-1的發(fā)酵液可與1.0 mM AgNO3快速反應制備納米銀粒子；制備的納米銀溶液中有93.4%的粒徑分布很窄，集中在3.0～10.0 nm之間，比文獻報道的最小粒徑進一步降低，且分散性良好；另外，制備的納米銀粒子對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性基本達到了同樣濃度AgNO3的抗菌效果，且其穩(wěn)定性和市場流通性遠高于AgNO3，可為抗菌材料的發(fā)展與推廣提供支持.