趙順新

(南京康寧司法鑒定中心，江蘇 南京 210000)

酒精對人的神經系統(tǒng)有一定的抑制作用，可以使人思維遲鈍，甚至產生幻覺。當前酒后駕車已經被列為車禍致死的主要原因。隨著新交通法的實施，酒駕相關的檢測也日趨普遍，而乙醇含量是認定行為人是否醉酒駕駛的關鍵性證據。駕駛員血液中乙醇濃度大于等于20 mg/100 mL小于80 mg/100 mL為飲酒后駕車，大于等于80 mg/100 mL則為醉酒后駕車[1]。

隨著科學技術的發(fā)展，出現了各種各樣檢測血液中乙醇含量的方法，包括酶法、化學法、頂空氣相色譜法和頂空氣相色譜-質譜法[2-5]等。其中，頂空氣相色譜法是最為常用并被納入公共安全行業(yè)標準的方法。目前能夠適用的檢驗方法為GA/T 1073—2013[6]和GA/T 842—2019[7]。《司法鑒定/法庭科學機構能力認可準則》[8](CNAS-CL08:2018)7.2.1.5鑒定機構在引入方法之前，應驗證能夠正確運用該方法，以確保實現所需的方法性能要求。并保留方法驗證的記錄，當方法發(fā)生變更或修訂時，應重新進行適當程度的驗證。

在檢測血液中乙醇含量的過程中，檢測人員、所使用的儀器設備、標準品溶液、檢測方法、環(huán)境條件等都會影響檢測結果，這些均為血液中乙醇檢測不確定度的來源。不確定度越大，檢測結果距離真值越遠，不確定度越小，檢測結果距離真值越近，所以不確定度也可以反應一個實驗室的檢測水平[9,10]。

本文參照GA/T 842—2019標準，并依據GB/T 27417—2017《化學分析方法確認和驗證指南》[11]和《法醫(yī)毒物分析方法驗證通則》[12]，利用雙柱雙檢測器頂空氣相色譜法對血液中乙醇含量的測定進行方法驗證，證實筆者所在實驗室具備使用該標準方法的條件，能夠按照方法要求出具科學、準確、公正的實驗數據。

1 材料與方法

1.1 儀器

PerkinElmer Clarus 500氣相色譜儀(鉑金埃爾默股份有限公司)，PerkinElmer TurboMatrix40頂空自動進樣器(鉑金埃爾默股份有限公司)，100 μL移液槍，1 000 μL移液槍。

1.2 試劑

乙醇標準溶液(5、10、20、50、80、200、300 mg/100 mL，純度≥99.9%，sigma aldrich)，叔丁醇(純度≥99.8%，sigma aldrich)，血液中乙醇樣品-1，血液中乙醇樣品-2(司法部司法鑒定科學研究院)。

1.3 溶液的配制

叔丁醇內標溶液：稱取適量的叔丁醇標準品置于500 mL容量瓶中，添加去離子水至刻度，混勻，得500 mg/100 mL叔丁醇對照品標準儲備溶液，將儲備液用水稀釋得4 mg/100 mL叔丁醇內標工作液。

1.4 實驗方法

1.4.1 HS-GC條件

PerkinElmerClarus 500氣相色譜儀，色譜條件：毛細管色譜柱A柱：Elite-BAC1(30 m×1.8 μm×0.32 mm)；B柱：Elite-BAC2(30 m×1.2 μm×0.32 mm)；柱溫：50 ℃；檢測器：火焰離子化檢測器(FID1，FID2)；檢測器溫度：200 ℃；進樣口溫度：250 ℃。PerkinElmer TurboMatrix40頂空自動進樣器，頂空爐溫：65 ℃；取樣針溫度：90 ℃；傳輸線溫度：110 ℃；樣品瓶加熱平衡時間10 min。

1.4.2 校準曲線制備

分別移取100 μL系列濃度乙醇標準溶液(5、10、20、50、80、200、300 mg/100 mL)，加入20 mL頂空瓶中，然后均加入500 μL叔丁醇內標工作液，每個濃度點的標準溶液獨立重復測定5次。每個濃度點后均分析空白樣以評價延遲效應。

1.4.3 樣品分析

分別移取100 μL血液中乙醇樣品-1和血液中乙醇樣品-2血樣各兩份，加入20 mL頂空瓶中，然后加入500 μL叔丁醇內標工作液，作頂空進樣分析。

2 結果

2.1 校準曲線和延遲效應

按實驗方法對系列濃度乙醇標準溶液進行測定，乙醇的質量濃度在5.0～300.0 mg/100 mL范圍均未見延遲效應。

用乙醇濃度值為橫坐標，乙醇與叔丁醇內標的峰面積比為縱坐標，5次重復測量數據疊加作圖，得到校準曲線見圖1和圖2，標準曲線殘差值的分布見圖3和圖4。在濃度范圍5～300 mg/100 mL內，A通道的線性回歸方程為Y=0.010 983X-0.019 970，相關系數R2=0.999 967；B通道的線性回歸方程為Y=0.011 148X-0.012 749，相關系數R2=0.999 947，兩個通道的線性相關系數R2均大于0.999，標準曲線殘差值以0為中心隨機分布，因此線性方程回歸成立，且繪制的校準曲線線性良好，滿足日常檢測分析的需要。

圖1 A通道校準曲線Fig. 1 Linear regression equation of channel A

圖2 B通道校準曲線Fig. 2 Linear regression equation of channel B

圖3 A通道標準殘差值Fig. 3 Standard residuals of channel A

圖4 B通道標準殘差值Fig. 4 Standard residuals of channel B

2.2 檢出限和定量限

選擇三個來源不同的空白血液，逐步稀釋乙醇標準溶液，每個批次重復測定三次，同時記錄乙醇的信噪比，S/N≥3且符合定性要求的添加樣品最低濃度為1 mg/100 mL，即為方法的檢出限。定量限為校準曲線最低濃度點(5 mg/100 mL)，且此濃度點能滿足精密度和準確度的要求。

2.3 回收率和精密度

取同一空白血樣3份，分別添加乙醇標準溶液，使血液中乙醇的質量濃度分別為5 mg/100 mL、50 mg/100 mL和150 mg/100 mL。每個濃度點配制三個質控樣，連續(xù)測定5天，計算日內精密度、日間精密度和回收率，見表1，表2。

表1 日內精密度實驗結果(n=3)Tab. 1 Results of within-day precision(n=3)

表2 回收率和日間精密度實驗結果(n=15)Tab. 2 Results of recovery rate and day to day precision(n=15)

結果表明該方法兩個通道進樣的日間精密度和日內精密度的相對標準偏差RSD均小于5.0%，說明測定數據間的波動性小。A通道的回收率在99.32～101.40%之間，B通道的回收率在99.40～100.20%之間，說明該方法回收率良好。即本方法精密度和回收率均符合日常檢測的需要。

2.4 樣品分析

2020年5月8日本中心收到2個標稱“血液中乙醇含量測定-1”和“血液中乙醇含量測定-2”的能力驗證樣品，將其編號為NL-2020-12-1和NL-2020-12-2。用所建立的方法對樣品進行分析，結果見表3。本實驗室選擇將相對標準偏差較好的A通道的數據反饋給能力驗證提供方。經確認，能力驗證結果為滿意，此方法能滿足中國合格評定國家認可委員會能力驗證計劃樣品測定的需要，同時也能滿足本實驗室法醫(yī)毒物相關樣品分析的需要。

表3 能力驗證樣品測定結果Tab. 3 Results of proficiency testing samples

2.5 不確定度

2.5.1 A類不確定度

來源于重復測定次數、檢測人員。

將質量濃度為80 mg/100 mL的血樣平行測定10次，結果如下：A通道：79.15、79.74、78.89、79.23、79.58、79.52、80.09、80.38、79.02、80.37 mg/100 mL；B通道：78.22、79.63、78.64、78.99、78.11、79.02、79.41、80.29、79.04、80.13 mg/100 mL來計算不確定度。

測定結果標準偏差：

(1)

測定平均值的相對標準不確定度：

(2)

經公式2計算：A通道樣品平行測定產生的相對標準不確定度urel(A)=2.16×10-3，B通道樣品平行測定產生的相對標準不確定度urel(A)=2.92×10-3。

2.5.2 B類不確定度

來源于校準曲線、乙醇標準溶液純度、移液器、氣相色譜和實驗室環(huán)境等。

2.5.2.1 校準曲線產生的不確定度

由以下公式可以計算校準曲線產生的不確定度:

(3)

SE為標準曲線峰面積殘差的標準差;

(4)

SXX為標準溶液濃度殘差的平方和；

(5)

urel(X)為校準曲線產生的相對標準不確定度。

經計算，A通道由校準曲線產生的相對標準不確定度為7.10×10-3，B通道由校準曲線產生的相對標準不確定度為4.99×10-4。

2.5.2.2 乙醇標準溶液引入的相對標準不確定度

乙醇標準溶液產生的不確定見表4。

表4 乙醇標準溶液純度的不確定度Tab. 4 Uncertainties of ethanol standard solution

2.5.2.3 移液器

(1) 取內標用移液器產生的相對標準不確定度

(2) 取血樣用移液器產生的相對標準不確定度

2.5.2.4 氣相色譜儀引入的相對標準不確定度

2.5.3 相對標準不確定度

相對標準不確定度分量的評定見表5：

表5 相對標準不確定度分量一覽表Tab. 5 Components of relative standard uncertainty

由以上分析可知，不確定度主要來源于樣品平行測定、校準曲線、對照品純度和氣相色譜儀，其余來源的不確定度可忽略。由合成標準不確定度公式計算出相對合成標準不確定度μrel=1.10×10-2(A通道)，μrel=1.02×10-2(B通道)。

實驗結果一般用擴展不確定度表示。擴展不確定度是由合成標準不確定度的倍數表示的測量不確定度，通常用符號U表示。它是將合成標準不確定度擴展k倍，k稱為包含因子。k值一般取2～3，多數情況取k=2。即U=k×μrel=2×1.10×10-2×79.60=1.75 mg/100 mL(A通道)；U=k×μrel=2×1.02×10-2×79.15=1.61 mg/100 mL(B通道)

本方法測得樣本中乙醇含量為：(79.60±1.75)mg/100 mL,k=2(A通道)；(79.15±1.61)mg/100 mL,k=2(B通道)。

3 結論

本次方法驗證線性范圍，檢出限和定量下限均滿足GA/T 842—2019《血液酒精含量的檢驗方法》的要求。高、中、低不同濃度血樣測定結果的相對標準偏差滿足生物樣品定量分析方法的RSD控制在15%以內的要求，精密度良好。A通道的回收率在99.32～101.40%之間，B通道的回收率在99.40～100.20%之間。證明本實驗室檢測血液中酒精含量的精密度和回收率能夠滿足方法的要求。通過方法驗證，確認GA/T 842—2019方法在本實驗室可行、適用。