萬彬彬 楊惠琴 (武漢市第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，湖北 武漢 430022)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)臨床特征主要為關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)腫脹與炎癥、慢性進(jìn)行性病程，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失，是一種頑固的慢性全身性自身免疫疾病〔1〕。其主要的病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)骨質(zhì)與軟骨的破壞及滑膜慢性炎癥，目前RA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但較多的研究提到Tregs與Th17細(xì)胞對其具有重要的影響〔2〕。RA發(fā)病可能是一種受抗原驅(qū)動(dòng)的“激發(fā)-連鎖反應(yīng)”過程，其發(fā)病與病情遷延的中心環(huán)節(jié)為感染與自身免疫反應(yīng)，而環(huán)境、遺傳與內(nèi)分泌因素等增加了RA的易感性〔3〕。多數(shù)西藥對RA也僅能在一定程度控制炎癥與疼痛，目前尚無特效藥，并不能有效地治療RA〔4,5〕。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，RA屬“痹癥”范疇，深入了解RA療效機(jī)制，對提高患者生活質(zhì)量意義重大，尪痹舒具有活血通絡(luò)、祛風(fēng)止痛、滋補(bǔ)肝腎、益氣補(bǔ)血等功效〔6〕。本文探討尪痹舒通過調(diào)控Th17/Tregs平衡緩解RA進(jìn)展的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只清潔級、SD大鼠，6～8周齡，平均(6.9±0.6)周齡，體重200～230 g，平均(215.4±20.6)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供〔動(dòng)物批準(zhǔn)文號：SCXK(滬)2013-0018〕，大鼠實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性飼養(yǎng)在中科院動(dòng)物飼養(yǎng)中心，且經(jīng)中科院倫理委員會批準(zhǔn)。主要試劑及儀器：甲氨蝶呤(通化茂祥制藥有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字H22022674，規(guī)格2.5 mg×100片)；完全弗氏佐劑(上海尚寶生物科技有限公司生產(chǎn)，型號：F5881-10)；顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；一抗、二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo-fisher公司)。

1.2RA模型建立 模型組、甲氨蝶呤組及尪痹舒組大鼠腹腔麻醉使用5%水合氯醛0.8 ml/100 g，常規(guī)皮膚消毒在右后足跖底部取3個(gè)點(diǎn)，皮內(nèi)注射0.1 ml完全弗氏佐劑。正常組處理方法與其他組相同，完全弗氏佐劑使用生理鹽水代替。

1.3用藥及分組 建模成功，正常組大鼠10只，將其他大鼠隨機(jī)分為模型組、甲氨蝶呤組及尪痹舒組各10只，正常組、模型組給予等量的生理鹽水；甲氨蝶呤組給予甲氨蝶呤10 mg，1次/w；尪痹舒組給予尪痹舒，藥物組成：馬錢子0.3 g、白芥子5 g、赤芍10 g、香附5 g、黃柏3 g、蒼術(shù)6 g、僵蠶3 g組成，煎服300 ml，1劑/d，分3次用藥，連續(xù)干預(yù)4 w。

1.4觀察指標(biāo) 關(guān)節(jié)腫脹數(shù)使用游標(biāo)卡尺測量4組大鼠雙后肢足墊厚度，兩個(gè)分值相加為每只大鼠關(guān)節(jié)評分；關(guān)節(jié)疼痛指數(shù)、關(guān)節(jié)壓痛指數(shù)采用慢性關(guān)節(jié)測定評分方法測定，大鼠安靜時(shí)檢測，固定10 min后，每隔5 s進(jìn)行1次，大鼠踝關(guān)節(jié)做被動(dòng)跖屈運(yùn)動(dòng)，共5次，取平均值，根據(jù)大鼠嘶叫與縮腿反應(yīng)。

1.5病理學(xué)觀察 干預(yù)后，取后踝關(guān)節(jié)部分分離關(guān)節(jié)滑膜組織，10%甲醛固定24 h，經(jīng)脫鈣、脫水、透明及包埋等處理制成石蠟塊，保存待用。將組織進(jìn)行切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.6類風(fēng)濕因子(RF)、C反應(yīng)蛋白(CRP)及紅細(xì)胞沉降率(ESR)水平檢測 干預(yù)后，抽取大鼠下腔靜脈血3 ml，以1 000 r/min低溫離心15 min，取血清。采用免疫比濁法檢測RF水平；采用ELISA檢測CRP水平；采用魏氏血沉法檢測ESR水平。

1.7轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、白細(xì)胞介素(IL)-17及IL-10水平檢測 采用雙抗體夾心法檢測TGF-β1、IL-17及IL-10水平。

1.8Western印跡檢測核孤兒受體(ROR)-γt、叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Fox)p3蛋白 將所采集到的所有標(biāo)本，進(jìn)行研磨，然后加入蛋白緩沖液，常規(guī)蛋白提取，二喹啉甲酸(BCA)法定量分析。50 μg蛋白樣品上樣后十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在TBST中將5%的脫脂奶粉避光封閉1 h，洗滌后加入一抗稀釋溶液(ROR-γt、Foxp3按照1∶1 000比例進(jìn)行稀釋)，在4℃的環(huán)境中保存過夜，洗滌后加入二抗稀釋溶液(ROR-γt、Foxp3按照1∶5 000比例進(jìn)行稀釋)，在溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)液，使軟件分析蛋白條帶灰度值，內(nèi)參蛋白是GAPDH。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.14組關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、關(guān)節(jié)疼痛指數(shù)與關(guān)節(jié)壓痛指數(shù)比較 與正常組比較，其余3組關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、關(guān)節(jié)疼痛指數(shù)與關(guān)節(jié)壓痛指數(shù)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，甲氨蝶呤組、尪痹舒組關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、關(guān)節(jié)疼痛指數(shù)與關(guān)節(jié)壓痛指數(shù)明顯降低(P<0.05)；與甲氨蝶呤組比較，尪痹舒組關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、關(guān)節(jié)疼痛指數(shù)與關(guān)節(jié)壓痛指數(shù)明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 4組關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、關(guān)節(jié)疼痛指數(shù)與 關(guān)節(jié)壓痛指數(shù)比較分，n=10)

2.24組關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察 正常組膝關(guān)節(jié)滑膜無充血及水腫，細(xì)胞排列整齊，關(guān)節(jié)軟骨完整，無炎性細(xì)胞浸潤，無剝離及壞死，組織完整；模型組關(guān)節(jié)軟骨面糜爛，滑膜內(nèi)血管增生，肉芽組織形成，細(xì)胞顯著增生；甲氨蝶呤組滑膜血管水腫、充血，見炎性細(xì)胞浸潤，表層細(xì)胞增，呈“柵欄”狀排列；尪痹舒組未見明顯炎細(xì)胞浸潤及血管增生，間質(zhì)多為脂肪組織，纖維化不明顯，充血程度、滑膜腫脹及滑膜細(xì)胞增生減輕。見圖1。

圖1 4組關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察(HE染色，×200)

2.34組RF、CRP及ESR水平比較 與正常組比較，其余3組RF、CRP及ESR水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，甲氨蝶呤組、尪痹舒組RF、CRP及ESR水平明顯降低(P<0.05)；與甲氨蝶呤組比較，尪痹舒組RF、CRP及ESR水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.44組TGF-β1、IL-17及IL-10水平比較 與正常組比較，其余3組IL-17水平明顯升高，TGF-β1、IL-10水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，甲氨蝶呤組及尪痹舒組IL-17水平明顯降低，TGF-β1、IL-10水平明顯升高(P<0.05)；與甲氨蝶呤組比較，尪痹舒組IL-17水平明顯降低，TGF-β1、IL-10水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

2.54組ROR-γt、Foxp3蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，其余3組ROR-γt蛋白表達(dá)明顯升高，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，甲氨蝶呤組、尪痹舒組ROR-γt蛋白表達(dá)明顯降低，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與甲氨蝶呤組比較，尪痹舒組ROR-γt蛋白表達(dá)明顯降低，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見表3、圖2。

表2 4組RF、CRP、ESR、TGF-β1、IL-17及IL-10水平比較

表3 4組ROR-γt、Foxp3蛋白表達(dá)比較

圖2 4組ROR-γt、Foxp3蛋白表達(dá)

3 討 論

RA經(jīng)常伴有關(guān)節(jié)外器官受累，致殘與致畸率較高，其病程長，是臨床上常見的高致殘性風(fēng)濕免疫病，是一種進(jìn)行性、慢性的累及關(guān)節(jié)的自身免疫性疾病〔7〕。RA患病率在我國較高，很多患者沒有接受規(guī)范治療，患病人群構(gòu)成復(fù)雜，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。RA中醫(yī)學(xué)上屬痹癥，痹，即痹阻不通，《臨證指南醫(yī)案》〔8〕中指出痹者，臟腑經(jīng)絡(luò)不能暢達(dá)，正氣為邪所阻，閉而不通之謂，濕、寒、風(fēng)三氣得以乘虛外襲，體內(nèi)留置，導(dǎo)致濕痰濁血留注凝澀而德之〔9〕。相關(guān)研究表明，痰瘀是本病中晚期發(fā)病的重要病理因素，正氣虧虛為本，多以濕熱偏盛為主，病情遷延郁久化熱，從陽化熱，復(fù)感外邪〔10〕。

尪痹舒中黃柏、蒼術(shù)、僵蠶組成,黃柏、蒼術(shù)即二妙散具清熱燥濕功效，為濕熱痹痛常用藥。白芥子具有豁痰利氣，散結(jié)通絡(luò)止痛，僵蠶具有化痰散結(jié)、祛風(fēng)止痛解痙的功效，兩者聯(lián)合用于治療痰濕流注，關(guān)節(jié)腫脹麻木、疼痛諸癥。馬錢子，通絡(luò)止痛，散結(jié)消腫。赤芍具有清熱涼血、散瘀止痛的功能。香附為佐藥具有利三焦、解六郁的功用，有和胃理氣止痛作用，為氣病之總司但對痰、瘀、食、濕等諸郁均有效，對于以上諸藥對胃的刺激有一定的緩解作用。諸藥和用共奏清熱除濕、祛痰活血、通痹消腫的功效。本研究說明尪痹舒顯著改善關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、關(guān)節(jié)疼痛指數(shù)與關(guān)節(jié)壓痛指數(shù)。赤芍涼血活血、清熱，對細(xì)菌有明顯的抑制作用〔11〕。本研究說明尪痹舒顯著降低RF、CRP及ESR水平。Tregs細(xì)胞通過釋放細(xì)胞因子IL-10等降低炎癥因子產(chǎn)生與抗體分泌，是T細(xì)胞亞群中具有免疫抑制活性的一類，發(fā)揮免疫效應(yīng)〔12〕。IL-17在RA早期炎癥反應(yīng)中起重要作用，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞釋放促炎因子，上調(diào)免疫應(yīng)答，促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞釋放IL-8、IL-6，導(dǎo)致滑膜異常增生〔13〕。TGF-β1與關(guān)節(jié)炎的病理改變有關(guān)，可顯著抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)〔14〕。機(jī)體Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的失衡與相關(guān)細(xì)胞因子的異常在RA的發(fā)病中發(fā)揮重要的作用，是與免疫細(xì)胞比例異常的重要原因〔15〕。Th17細(xì)胞/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群失衡可導(dǎo)致RA骨質(zhì)破壞。Th17細(xì)胞可分泌IL-17，IL-17能夠?qū)?xì)胞外基質(zhì)損傷起到促進(jìn)愈合作用，也可對組織炎癥具有明顯的促進(jìn)作用〔16〕。Tregs細(xì)胞可通過產(chǎn)生的細(xì)胞因子包括TGF-β1與IL-10等在RA中起免疫抑制作用，也可直接發(fā)揮免疫抑制作用〔17,18〕。本研究結(jié)果說明尪痹舒顯著改善炎癥反應(yīng)。此外，尪痹舒明顯降低ROR-γt蛋白表達(dá)，升高Foxp3蛋白表達(dá)。Foxp3蛋白是Tregs的特異性標(biāo)志物，維持Tregs活性的關(guān)鍵因素為Foxp3持續(xù)表達(dá)〔19〕。ROR-γt是Th17細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，作為促進(jìn)細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子參與了體內(nèi)Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及體外細(xì)胞因子誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化〔20〕。

綜上，尪痹舒可通過誘導(dǎo)Tregs細(xì)胞生成同時(shí)抑制Th17細(xì)胞分化，是病變部位Th17/Tregs恢復(fù)平衡，可調(diào)控Th17/Tregs改善炎癥反應(yīng)與ROR-γt、Foxp3蛋白表達(dá)。