邵延萱 羅文哲 崔延昆 張雪松 盛延良 殷悅

(佳木斯大學(xué) 1臨床醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

腦卒中是發(fā)病突然的一類因腦血液循環(huán)障礙所引起的疾病，死亡率為60.0%。其中，因缺血所引起的腦卒中約占所有腦卒中病例的87.0%。腦組織缺血性死亡可引起炎癥和腦水腫，預(yù)后惡化。研究表明多種疾病，如血栓形成、心血管系統(tǒng)疾病、哮喘、肥胖、結(jié)腸炎、結(jié)腸癌及一些精神疾病和神經(jīng)退行性疾病，均可由腸道菌群失調(diào)而引起。而腦腸軸雙向作用機制的提出，為腸道微生物與腦血管病之間的研究提供了有力的科學(xué)支撐，腸道微生物菌群與腦之間可能存在多種方式進行聯(lián)系及相互影響〔1〕。本研究旨在從益生菌調(diào)整腸道微生態(tài)學(xué)角度闡明缺血性腦損傷與炎癥的關(guān)系及潛在的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級SD雄性大鼠〔(240±20)g，9周齡〕由佳木斯大學(xué)實驗動物中心機構(gòu)提供。在溫度23～25℃，濕度13%，氧氣充足條件下飼養(yǎng)。所有動物研究按照佳木斯大學(xué)實驗動物中心機構(gòu)動物倫理關(guān)懷委員會批準(zhǔn)的方案和指南進行。

1.1.2材料與儀器 水合氯醛、酒精、二甲苯、蘇木素、伊紅、磷酸鹽緩沖液(PBS)等(北京化學(xué)試劑六廠)；目的蛋白及內(nèi)參一抗(CST公司)；鼠李糖桿菌(山東中科嘉億生物工程有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢酶免生物科技有限公司)。電泳儀、恒溫水浴鍋(北京六一儀器廠)；圖像采集系統(tǒng)(萊卡顯微鏡)；離心機(上海知正離心機公司)；切片機、封片機(新鄉(xiāng)市維克科教儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組 選取15只大鼠(200～250 g)，隨機分為3組，每組5只，分別為：假手術(shù)組(A組，所做切口不結(jié)扎+生理鹽水)；頸動脈結(jié)扎+生理鹽水組(B組)；頸動脈結(jié)扎+鼠李糖桿菌組(C組)。建模后飼養(yǎng)14 d，給予足夠飲食與水，每天監(jiān)測體重。

1.2.2缺血腦損傷動物模型 麻醉大鼠(10%水合氯醛，3 ml/kg)，平臥，固定，頸部行縱向切口。分離胸鎖乳突肌，暴露右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，分別隔離。用6-0絲線在兩側(cè)頸總動脈進行結(jié)扎，為了保證效果，在動脈的遠(yuǎn)端和近端進行雙重處理；A組僅做切口與分離處理，但并不進行結(jié)扎，傷口用碘消毒并縫合。腦缺血模型建立后，大鼠出現(xiàn)雙目失明和繞圈行走，不能直線行走。根據(jù)Longa評分法〔2〕評價測試結(jié)果為3分，表明成功建立腦缺血模型，能夠模擬缺血性腦卒中的疾病狀態(tài)。動物模型構(gòu)建成功后采外周血，離心并進行低溫保存。取小腸，腸標(biāo)本的采集于各組規(guī)定時間進行解剖開腹取小腸，采用0.9%氯化鈉進行沖洗，再進行固定。取腦組織，一部分在甲醛溶液內(nèi)固定，用于組織形態(tài)學(xué)檢測；一部分-80℃凍存，用于后期檢測分析。

1.2.3ELISA 取2 ml外周血離心，離心時間20 min，離心速度3 500 r/min，將每支試管中上清液取出，-20℃保存。根據(jù)ELISA試劑盒說明書，檢測腦及腸中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β及外周血中血栓素(TX)B2水平。

1.2.4石蠟切片的制作 取大鼠大腦及小腸部，用FAA液進行固定，流水沖洗。乙醇低到高濃度梯度脫水，二甲苯+無水酒精混合液透明1 h。將材料放入溶解的純蠟中，時間為30 min，該過程再重復(fù)2次。包埋機器包埋組織塊，實驗前切片。

1.2.5免疫組化檢測 石蠟切片脫蠟。3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min。5%～10%正常山羊血清(PBS 稀釋)封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1～2 h或4℃過夜。PBS沖洗，滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育10～30 min。PBS沖洗，滴加適量的辣根過氧化物酶，37℃孵育10～30 min。PBS沖洗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色3～15 min，自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。腦組織樣本進行免疫組化檢測Toll樣受體(TLR)4、髓樣分化因子(MyD)88、核因子(NF)-κB、內(nèi)皮細(xì)胞閉合蛋白(occludin)、緊密連接蛋白(Clandin)-1、閉鎖小帶蛋白(ZO)-1。腸組織樣本進行免疫組化檢測Occludin、Clandin-1、ZO-1。

1.2.6Western印跡 將組織與裂解液按照100 mg∶1 ml的比例進行處理，保持低溫，快速勻漿，4℃ 12 000 r/min離心5 min，取部分上清液進行定量，加結(jié)合緩沖液95～100℃處理5 min，冷凍保存或上樣。電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-一抗過夜-TBST清洗-二抗室溫1 h-TBST清洗-化學(xué)發(fā)光成像。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用Graphpad Prism9.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組炎性因子水平比較 A組外周血TXB2及腦和腸中TNF-α、IL-1β水平均顯著低于B組，B組外周血TXB2及腦和腸中TNF-α、IL-1β水平均顯著高于C組(P<0.05)。見表1。

表1 各組炎性因子水平比較

2.2各組TLR4-NF-κB信號通路相關(guān)蛋白水平比較 A組TLR4、NF-κB、MyD88水平均顯著低于B組，B組TLR4、NF-κB、MyD88水平均顯著高于C組(P<0.05)。見表2、圖1。

2.3各組腦及腸組織中緊密連接蛋白水平比較 腦及腸組織中Occludin、Clandin-1、ZO-1水平比較：A組>C組>B組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、表4、圖2、圖3。

表2 各組TLR4-NF-κB信號通路相關(guān)蛋白 水平比較

圖1 腦部TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(免疫組化，×400)

表3 各組腦組織中緊密連接蛋白水平比較

表4 各組腸組織中緊密連接蛋白水平比較

圖2 腦部ZO-1、Occludin、Clandin-1水平(免疫組化，×400)

圖3 腸部ZO-1、Occludin、Clandin-1水平(免疫組化，×400)

3 討 論

缺血性腦損傷由于供血異常而引起機體供氧量異常及新陳代謝會發(fā)生變化〔3〕，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，當(dāng)被激活后，可釋放大量炎癥和細(xì)胞毒性介質(zhì)，這些介質(zhì)與神經(jīng)功能障礙和腦損傷有關(guān)〔4〕。小膠質(zhì)細(xì)胞表達的TLRs是模式識別受體的一個亞家族，識別入侵的病原體和內(nèi)源性有害刺激，從而誘發(fā)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)〔5〕。其中TLR4是常見的研究對象，通過介導(dǎo)NF-κB信號通路，進而影響炎性因子的表達。研究證明脂多糖(LPS)等炎性因子與TLR4結(jié)合，通過MyD88途徑介導(dǎo)炎癥〔6〕?；罨腡LR結(jié)構(gòu)域結(jié)合MyD88形成TLR-MyD88復(fù)合體，導(dǎo)致下游蛋白IRAK1和TRAF6的磷酸化，激活NF-κB信號通路并進入細(xì)胞核調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達。研究證明胡椒堿通過抑制NF-κB信號通路中 kappa 光多肽核因子增強子的表達，進而抑制促炎性細(xì)胞因子的表達〔7〕。

血腦屏障(BBB)的內(nèi)皮細(xì)胞與緊密連接蛋白相互接觸，包括Occludin，ZO-1和Claudins，它們與相鄰的內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，形成阻止細(xì)胞旁擴散的物理屏障〔8〕?？梢哉fBBB的功能依賴于緊密連接蛋白的完整性。本研究結(jié)果表明腸屏障(IB)和BBB的通透性變大。炎性因子表達的增強與緊密連接蛋白的表達下降綜合考慮可推測炎性因子的存在，導(dǎo)致IB、BBB產(chǎn)生相應(yīng)的變化。Chen等〔9〕血管周圍 M1樣小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞壞死導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)BBB受損，需要 M1型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α及其受體TNFR1介導(dǎo)。腸道細(xì)菌可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的生理功能和炎癥的發(fā)生〔10〕。

研究顯示導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎(UC) 癌變的一個可能原因是上皮細(xì)胞損傷和修復(fù)的重復(fù)周期〔11〕。在這個過程中可產(chǎn)生過多的促炎癥細(xì)胞因子，如TNF-α和IL-6。腸道微生物群可以影響 UC的發(fā)生〔12〕，因為它誘導(dǎo)了持續(xù)性腸道炎癥。益生菌被用作UC 患者的補充劑，對 UC的治療效果顯著〔13，14〕?？梢娋号c炎性因子的產(chǎn)生存在相關(guān)作用的可能。

綜上，缺血性腦損傷改變了腸道微生物群的組成，而益生菌可通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)降低缺血性腦損傷的損害。