胡陽(yáng) 鄧潔 王婷婷 姜華 羅勇 楊永麗 蘇慧鵬 王煜

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院 1老年病科，云南 昆明 650000；2消化科；3云南省楚雄州武定縣人民醫(yī)院心內(nèi)科)

慢性心力衰竭(CHF)是各種心血管疾病發(fā)展的最終階段，由于心肌收縮力減退，致前向血流減少和肺靜脈系統(tǒng)血流回流障礙，而交感神經(jīng)系統(tǒng)及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS) 的激活起代償作用。RAAS在心室重塑、心力衰竭(HF)的發(fā)展過(guò)程中起到重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)CHF時(shí)雄激素水平降低，雄激素水平下降又加重心功能不全。CHF患者雄激素水平降低,其可能參與了HF的病理生理過(guò)程。雄激素補(bǔ)充治療有可能通過(guò)激活磷脂酰激酶-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路改善心血管功能、增加運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度與時(shí)間、抑制導(dǎo)致CHF進(jìn)程的神經(jīng)激素。本研究探討雄激素對(duì)CHF大鼠心功能的影響。

1 材料與方法

1.1材料和試劑 成年雄性SD大鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002)。PI3K/Akt阻斷劑(LY294002)購(gòu)自Selleck公司。鹽酸阿霉素(ADR)購(gòu)自山西普德藥業(yè)有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H14023143)。丙酸睪酮(T)購(gòu)自寧波第二激素廠(chǎng)(獸藥字(2016)110251054)。p-Akt抗體購(gòu)自CST公司(貨號(hào)：9271)。Akt抗體購(gòu)自CST公司(貨號(hào)：9272)。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體購(gòu)自CST公司(貨號(hào)：9662)。TUNEL試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：C1082)。主要設(shè)備：MindrayM7便攜彩超診斷儀。

1.2CHF模型建立 成年雄性SD大鼠55只，體重220～250 g，8月齡以上，隨機(jī)分為對(duì)照(Control)組(10只)、CHF組(15只)、T+CHF組(15只)、LY294002+T+CHF組(15只)。CHF采用腹腔注射ADR，第2天、第4天ADR 1 mg/kg；第6天、第8天ADR 2 mg/kg；第10、第12天ADR 3 mg/kg；第14、第16天ADR 4 mg/kg。T干預(yù)是在開(kāi)始注射ADR同時(shí)經(jīng)過(guò)皮下注射丙酸T，每次劑量為2 mg/kg,每2 d 1次，共15次,累積劑量達(dá)30 mg/kg。抑制組建模：LY294002干預(yù)是在開(kāi)始注射ADR同時(shí)每天腹腔注射LY294002 50 mg/kg。而Control組和CHF組皮下注射相等體積的花生油及腹腔注射相等體積的生理鹽水。

1.3CHF模型的評(píng)估鑒定 ADR給藥30 d后使用MindrayM7便攜彩超診斷系統(tǒng)行超聲心動(dòng)檢測(cè)。異氟烷吸入麻醉大鼠，心前區(qū)備皮，仰臥位固定。檢測(cè)評(píng)估大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左心室收縮期內(nèi)徑(LVDs)、室間隔厚度(IVS)、心率(HR)、心臟射血分?jǐn)?shù)(EF)，所有超聲測(cè)量值取3個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

1.4測(cè)定血清雄激素水平 于ADR給藥30 d后，用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，采用20 μl的毛細(xì)管對(duì)大鼠進(jìn)行眼內(nèi)眥靜脈叢采血,收集靜脈血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內(nèi),4℃冰箱放置30 min,3 000 r/min離心15 min,吸取血漿,分裝后置于-80℃,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血漿中雄激素含量。具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.5TUNEL法測(cè)定心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 于ADR給藥30 d后，用10%的水合氯醛腹腔麻醉后處死，用4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)將心臟中血液沖洗干凈，在-80℃冷凍2 h。用冰凍切儀切成6 μm切片，切片應(yīng)用TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)對(duì)凋亡細(xì)胞的DNA進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素檢測(cè)試劑對(duì)TdT標(biāo)記，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。并且光鏡下觀察，凋亡細(xì)胞陽(yáng)性呈現(xiàn)棕黃色染色，正常為藍(lán)色。采用Image-ProPlus6.0軟件計(jì)數(shù)凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)，并計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6Western印跡檢測(cè)Caspase-3、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá) 為了探討PI3K/Akt通路是否為雄激素改善心功能通路之一，本研究采用抑制劑LY294002對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)行阻斷及補(bǔ)充雄激素。于ADR給藥30 d后，用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，用4℃ PBS將心臟中血液沖洗干凈，取心肌組織，使用組織勻漿器及RIPA裂解液提取心肌組織蛋白，使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)提取的蛋白進(jìn)行電泳，并使用聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)，按照不同分子量切取蛋白條帶按照對(duì)應(yīng)蛋白孵育一抗，使用山羊抗小鼠和山羊抗兔的二抗按照一抗來(lái)源不同孵育二抗，采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。

1.7免疫組化檢測(cè)心肌組織中Caspase-3、p-PI3K、p-Akt 蛋白的表達(dá) 為進(jìn)一步驗(yàn)證雄激素改善心功能通過(guò)激活PI3K/Akt通路減少心肌細(xì)胞凋亡，本研究將1.5步驟中冰凍切片通過(guò)3%H2O2去除內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶，使用羊血清對(duì)切片進(jìn)行封閉，分別按照Caspase-3(1∶100)、p-PI3K (1∶200)、p-Akt(1∶100)的一抗進(jìn)行孵育，使用免疫組化通用二抗試劑盒孵育，用DAB進(jìn)行顯色，使用蘇木素復(fù)染、梯度酒精常規(guī)脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察Caspase-3、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)情況，采用Image-ProPlus6.0軟件分析蛋白的表達(dá)情況。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD法，統(tǒng)計(jì)圖用GraphPad Prism6.0 軟件繪制。

2 結(jié) 果

2.1模型制作存活率 55只SD大鼠建模中死亡12只，分別為CHF組5只，T+CHF組3只，LY294002+T+CHF組4只，存活率為78.2%。

2.2各組心功能比較 與Control組比較，其余3組LVDd、LVDs明顯增大，EF明顯降低(P<0.05)。與CHF組比較，T+CHF組LVDd、LVDs、EF無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而HR明顯減慢(P<0.05)。與T+CHF組比較，LY294002+T+CHF組LVDd、LVDs無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而HR明顯加快，EF明顯降低(P<0.05)。各組IVS組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 ADR干預(yù)30 d各組心功能改變

2.3各組血清雄激素水平比較 與Control組〔(0.462±0.029)ng/ml〕比較，CHF組T水平〔(0.367±0.027)ng/ml〕明顯降低(P<0.05)；與CHF組比較，T+CHF和LY294002+T+CHF組血清T水平〔(0.519±0.018)、(0.528±0.068)ng/ml〕明顯升高(P<0.05)。

2.4TUNEL法測(cè)定CHF大鼠心肌細(xì)胞凋亡 ADR干預(yù)各組心肌細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)較多棕色細(xì)胞核碎裂顆粒，提示心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，見(jiàn)圖1。CHF組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)〔(33.835±5.819)個(gè)〕、Caspase-3蛋白表達(dá)(0.993±0.058)明顯高于Control組〔(17.204±3.825)個(gè)、0.305±0.011；P<0.05〕；T+CHF組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)〔(20.235±8.172)個(gè)〕、Caspase-3蛋白表達(dá)(0.505±0.010)較CHF組明顯改善(P<0.05)；LY294002+T+CHF組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)〔(30.125±4.314)個(gè)〕、Caspase-3蛋白表達(dá)(0.696±0.052)明顯高于T+CHF組(P<0.05)，與CHF組無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。提示補(bǔ)充雄激素減輕CHF大鼠的心肌細(xì)胞凋亡，且減輕心肌細(xì)胞凋亡的途徑與LY294002抑制的信號(hào)通路有關(guān)。

圖1 TUNEL法檢測(cè)各組心肌凋亡細(xì)胞(HE染色，×400)

1～4：Control組,CHF組,T+CHF組,LY294002+T+CHF組圖2 Western印跡檢測(cè)各組Caspase-3、 p-Akt、p-PI3K/Akt蛋白表達(dá)

2.5LY294002對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路阻斷檢測(cè) 與Control組p-Akt/Akt及p-PI3K/Akt蛋白表達(dá)(1.604±0.053、0.692±0.019)比較，CHF組(0.801±0.024、0.410±0.015)、T+CHF組(1.266±0.020、0.503±0.000)、L294002+T+CHF組(0.216±0.017、0.210±0.006)均明顯降低(均P<0.05)；與CHF組比較，T+CHF組明顯上升(P<0.05)；與T+CHF組比較，LY294002+CHF組明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。表明LY294002抑制劑可以在心肌中抑PI3K/Akt通路，同時(shí)說(shuō)明雄激素可以激活PI3K/Akt通路。

2.6免疫組化檢測(cè)心肌組織中p-Akt、p-PI3K、Caspase-3蛋白表達(dá)水平 LY294002抑制劑加入后p-AKT、p-PI3K蛋白表達(dá)降低而Caspase-3蛋白表達(dá)升高，補(bǔ)充雄激素后p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)升高而Caspase-3蛋白表達(dá)下降。見(jiàn)圖3。進(jìn)一步表明雄激素可能通過(guò)PI3K/Akt通路減輕心肌細(xì)胞凋亡從而改善心功能。

圖3 免疫組化檢測(cè)心肌組織中p-Akt、p-PI3K、Caspase-3蛋白表達(dá)(×200)

3 討 論

正常情況下T是維持生命體各臟器功能及結(jié)構(gòu)的重要內(nèi)分泌激素，T對(duì)維持心臟功能及結(jié)構(gòu)也起到一定作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)心血管系統(tǒng)對(duì)雄激素特別敏感，雄激素直接影響心血管系統(tǒng)的血管和心臟，血清T濃度會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而降低，T水平的降低與過(guò)早的冠狀動(dòng)脈疾病、對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病危險(xiǎn)因素的不利影響及與年齡無(wú)關(guān)的心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)〔1〕。越來(lái)越多的證據(jù)表明激素缺乏在CHF中起著重要作用〔2～6〕。特別是雄激素缺乏在CHF患者中很常見(jiàn)，并且與發(fā)病率和死亡率的增加有關(guān)〔7,8〕。

Jankowska等〔9〕對(duì)208例CHF患者和366名健康男性進(jìn)行對(duì)照研究，所有紐約心臟協(xié)會(huì)(NYHA)心功能分級(jí)的HF中都發(fā)現(xiàn)了較低的T水平。研究表明〔10〕，男性CHF患者T水平降低預(yù)示預(yù)后不良，并與死亡率增加有關(guān)。有研究也證實(shí)在CHF患者及大鼠外周循環(huán)中雄激素較正常對(duì)照組是降低的〔11,12〕。因此雄激素在HF患者中被證實(shí)是普遍減少的，但補(bǔ)充雄激素對(duì)改善心功能的是有分歧的。一項(xiàng)前瞻性、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照試驗(yàn)〔13〕比較CHF合并射血分?jǐn)?shù)降低(HFrEF)的T缺乏男性患者用T替代與安慰劑的療效，每3個(gè)月肌肉注射長(zhǎng)效十一酸T固定劑量為1 000 mg。安慰劑組接受等滲鹽水血清，患者在接受最佳藥物治療的同時(shí)，隨機(jī)分為T(mén)或安慰劑組，研究進(jìn)行了12個(gè)月，最終樣本包括29例患者，安慰劑組15例，T組14例〔年齡(65±8)歲，62%有缺血的病因，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)為(30±6)%，NYHA心功能分級(jí)Ⅱ占 69%〕。12個(gè)月后，T替代組T水平明顯增加(P=0.002)，但在臨床癥狀和功能方面〔包括NYHA分級(jí)、弗雷明漢評(píng)分、明尼蘇達(dá)生活性CHF問(wèn)卷、6 min步行距離(6MWD)、LVEF及距離N末端前腦鈉肽(NT-proBNP)〕未見(jiàn)獲益。未觀察到T治療相關(guān)的明顯不良反應(yīng)。在其他激素、代謝和骨代謝生物標(biāo)志物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)影響。在HFrEF和T缺乏癥患者中，替代治療無(wú)顯著成效。而另一項(xiàng)研究〔14〕選取50歲男性患有充血性HF的患者,安慰劑對(duì)照試驗(yàn)和試驗(yàn)組，試驗(yàn)組肌肉(臀部)長(zhǎng)效注射雄激素T(庚酸T 250 mg/ml)；對(duì)照組接受肌內(nèi)注射生理鹽水(1 ml)。兩組患者體重、血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)及左室容積超聲心動(dòng)圖指標(biāo)均具有可比性。對(duì)于舒張功能狀態(tài)的改變，使用心肌做功指數(shù)，使用睪酮后該參數(shù)得到明顯改善。與接受安慰劑的組不同，接受T組在研究期間的6MWD參數(shù)有顯著增加的趨勢(shì)(P=0.019)。在調(diào)整基線(xiàn)變量后，各研究組之間的6MWD變化趨勢(shì)差異仍然顯著(F=4.402,P=0.045)。本研究加強(qiáng)了對(duì)T在改善CHF患者功能能力和生活質(zhì)量中的有益作用。證實(shí)了適量補(bǔ)充雄激素可能有助于改善心功能。

目前有關(guān)雄激素在HF中的機(jī)制研究較少且不明確，有研究〔15〕認(rèn)為核因子(NF)-κB信號(hào)可能是T治療心肌益處的重要分子基礎(chǔ)。T有廣譜的免疫調(diào)節(jié)作用，可抑制巨噬細(xì)胞的活性，降低血漿腫瘤壞死因子(TNF)-α，研究發(fā)現(xiàn)T可抑制NF-κB的激活，上調(diào)NF-κB抑制物(Iκ-B)的表達(dá)，間接抑制中性粒細(xì)胞CD11/CD18的表達(dá)，從而抑制炎癥因子分泌。低T水平被發(fā)現(xiàn)與增加代謝風(fēng)險(xiǎn)和系統(tǒng)炎癥有關(guān)。由于脂肪組織是炎性細(xì)胞因子的來(lái)源，T可能通過(guò)作用于脂肪組織來(lái)調(diào)節(jié)炎癥。在冠狀動(dòng)脈疾病、前列腺癌和糖尿病患者中觀察到T可能抑制炎癥反應(yīng)，通過(guò)抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-10的增加和減少促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)來(lái)達(dá)到〔16〕。T缺乏與促炎細(xì)胞因子增加有關(guān)，T替代降低促炎細(xì)胞因子。也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)〔17〕證實(shí)T替代治療能減輕衰老大鼠心肌纖維化和凋亡，并認(rèn)為至少部分通過(guò)提高生長(zhǎng)停滯特異性蛋白(Gas)6的表達(dá)而減輕心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡。

PI3K-Akt通路是心肌細(xì)胞凋亡的重要通路，PIP3可以與下游的信號(hào)分子3-磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶(PDK)及Akt結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。Akt(PKB)可被PDK1和PDK2磷酸化而激活，產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，如促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GluT)1和4轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，攝取葡萄糖，蛋白質(zhì)合成，抑制細(xì)胞凋亡等。本研究說(shuō)明雄激素可能有激活PI3K/Akt通路的作用。另外Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶。Caspase-3最主要的底物與DNA修復(fù)、基因完整性監(jiān)護(hù)有關(guān)，Caspase-3對(duì)于細(xì)胞的凋亡具有明顯的促進(jìn)作用〔18，19〕。本研究結(jié)果表明雄激素通過(guò)激活PI3K/Akt通路緩解心肌細(xì)胞凋亡從而改善心功能。免疫組化結(jié)果進(jìn)一步表明雄激素可通過(guò)PI3K/Akt通路減少心肌細(xì)胞凋亡從而改善心功能。

目前超生理劑量下，雄激素可能有毒性作用，有研究〔20〕顯示半胱氨酸T和司他諾佐洛爾可合成代謝型雄激素(AAS)，是一種具有類(lèi)似T功能的合成物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)中使用了30只雌性瑞士老鼠。動(dòng)物接受超生理劑量的AAS 30 d，兩種AAS均顯著改變心臟形態(tài):丙酸T導(dǎo)致心室腔增大，司他諾佐洛爾增加左心室心肌厚度?？傊诔^(guò)生理劑量下使用AAS可改變心臟形態(tài)，可能?chē)?yán)重影響健康。在生理水平上，T是安全的，并對(duì)心肌功能產(chǎn)生有益影響。多種激素和代謝紊亂與CHF的發(fā)展之間的聯(lián)系已成為研究熱點(diǎn)〔21〕，合成代謝力和分解代謝力的失衡可能是CHF發(fā)生的原因。激素替代治療的有益影響有助于改善CHF的進(jìn)程，雄激素可能在其中發(fā)揮重要作用。