梁勇 武軍元 劉禹賡 劉波 魏兵 張向群 曾紅

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 1西區(qū)急診科，北京 100043;2急診科)

急性腎損傷(AKI)是膿毒癥最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，發(fā)病率及死亡率較高，重癥監(jiān)護(hù)病房住院患者中約50%的AKI由膿毒癥引起〔1〕。脂多糖(LPS)是主要的內(nèi)毒素之一，其通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，凋亡在膿毒癥相關(guān)AKI發(fā)病中具有重要作用〔2〕。AKI可引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡又進(jìn)一步促進(jìn)AKI進(jìn)展。因此，有效減輕LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷對AKI治療具有重要意義。連翹苷為中藥連翹的主要藥理成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗過敏、抗腫瘤等多種藥理活性。研究證實(shí)連翹苷可減輕急性肺損傷肺組織病理損傷程度，抑制炎癥反應(yīng)〔3〕。連翹苷還可改善膿毒癥大鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)、微血管凝血及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等因素，提高大鼠存活率〔4，5〕。miR-146a是許多心血管疾病的保護(hù)因子，上調(diào)miR-146a表達(dá)可減弱阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性，改善膿毒癥誘導(dǎo)的心肌功能障礙〔6，7〕。AKI小鼠腎組織中miR-146a表達(dá)降低，褪黑素通過抑制炎癥反應(yīng)，對AKI具有明顯治療作用〔8〕。本研究旨在探討連翹苷對LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞HK-2凋亡、氧化應(yīng)激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑 人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞HK-2購于武漢普諾賽生命科技公司；miR-146a模擬物(mimics)、miR-146a抑制物(inhibitor)、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購于上海生工公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購于北京寶日醫(yī)生物公司；兔源B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購于美國CST公司；丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)活性檢測試劑盒購于北京索萊寶生物公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 HK-2細(xì)胞采用補(bǔ)充10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的MEM培養(yǎng)基在含5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞70%融合時，按照1∶4比例轉(zhuǎn)移細(xì)胞至新的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，換液頻率為每周2～3次。采用1 μg/ml LPS干預(yù)對數(shù)期HK-2細(xì)胞6 h記為模型(Model)組〔9〕。Con組正常培養(yǎng)細(xì)胞，不用LPS干預(yù)。采用5、10、20 ng/ml的連翹苷分別處理LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞24 h，依次記為實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-146a mimic轉(zhuǎn)染HK-2，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行LPS干預(yù)處理記為Model+miR-146a mimic組。將miR-146a inhibitor轉(zhuǎn)染HK-2，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行LPS干預(yù)處理6 h，然后用20 ng/ml的連翹苷處理24 h，記為實(shí)驗(yàn)3+miR-146a inhibitor組。

1.3實(shí)時熒光定量-PCR檢測miR-146a表達(dá) TRIzol試劑提取各組HK-2細(xì)胞的總RNA，隨后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR。2-ΔΔCt法計(jì)算miR-146a相對表達(dá)量。miR-146a上游引物5′-GCAGGGTCCGAGGTATTCG-3′，下游引物5′-CGCGTGAGAACTGAATTCCAT-3′；內(nèi)參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4CCK-8法檢測細(xì)胞活力 將各組細(xì)胞以每孔2×105個細(xì)胞的密度接種96孔板，貼壁后每孔中加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h后，酶標(biāo)儀分析450 nm處各孔光密度(OD)值。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次，隨后用1×結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/ml。在100 μl細(xì)胞懸液中各加入5 μl的Annexin V-FITC和PI進(jìn)行暗室染色。補(bǔ)加400 μl的1×結(jié)合緩沖液混勻后上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6Western印跡檢測Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) 采用補(bǔ)充蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀試驗(yàn)緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸對總蛋白進(jìn)行定量。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣品，濕法轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。將膜置于含有5%脫脂牛奶的洗膜緩沖液中4℃封閉過夜，將膜與一抗室溫孵育2 h，將膜再與二抗室溫孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑顯色，GAPDH作為內(nèi)源性對照，Image J軟件對目的條帶灰度進(jìn)行定量分析。

1.7試劑盒檢測細(xì)胞中MDA含量、SOD和GSH活性 收集各組細(xì)胞至離心管內(nèi)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入提取液超聲破碎細(xì)胞，離心收集上清液后置于冰上。按照MDA含量、SOD活性、GSH活性檢測試劑盒步驟測定各組HK-2細(xì)胞中MDA含量、SOD和GSH活性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1連翹苷對LPS作用的HK-2細(xì)胞活性及miR-146a表達(dá)的影響 與Con組比較，Model組HK-2細(xì)胞miR-146a表達(dá)水平、OD值顯著降低(P<0.05)；與Model組比較，實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組HK-2細(xì)胞miR-146a表達(dá)水平、OD值顯著升高(P<0.05)。隨著連翹苷濃度的逐步增加，HK-2細(xì)胞miR-146a表達(dá)水平、OD值逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 連翹苷對LPS作用的HK-2細(xì)胞活性及 miR-146a表達(dá)的影響

2.2連翹苷對LPS作用的HK-2凋亡的影響 與Con組比較，Model組HK-2細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與Model組比較，實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組HK-2細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。隨著連翹苷濃度的逐步增加，HK-2細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)逐漸降低，Bcl-2蛋白逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表2。

1～5：Con組、Model組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組圖1 連翹苷對LPS作用的HK-2凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表2 連翹苷對LPS作用的HK-2凋亡的影響

2.3連翹苷對LPS作用的HK-2氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較，Model組HK-2細(xì)胞SOD和GSH水平顯著降低，MDA水平顯著升高(P<0.05)；與Model組比較，實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組HK-2細(xì)胞SOD和GSH水平顯著升高，MDA水平顯著降低(P<0.05)。隨著連翹苷濃度的逐步增加，HK-2細(xì)胞SOD和GSH水平逐漸升高，MDA水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 連翹苷對LPS作用的HK-2氧化應(yīng)激的 影響

2.4過表達(dá)miR-146a對LPS作用的HK-2細(xì)胞活性、凋亡及氧化應(yīng)激的影響 與Model組比較，過表達(dá)miR-146a后HK-2細(xì)胞OD值、Bcl-2、SOD和GSH水平顯著升高，凋亡率、Bax、MDA水平顯著降低(P<0.05)。見圖2、表4。

1，2：Model組、Model+miR-146a mimic組圖2 過表達(dá)miR-146a對LPS作用的HK-2凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表4 過表達(dá)miR-146a對LPS作用的HK-2細(xì)胞活性、凋亡及氧化應(yīng)激的影響

2.5抑制miR-146a可逆轉(zhuǎn)連翹苷對LPS作用的HK-2細(xì)胞活性、凋亡及氧化應(yīng)激的影響 與實(shí)驗(yàn)3組比較，實(shí)驗(yàn)3+miR-146a inhibitor組HK-2細(xì)胞OD值、Bcl-2、SOD和GSH水平顯著降低，凋亡率、Bax、MDA水平顯著升高(P<0.05)。見表5、圖3。

表5 抑制miR-146a可逆轉(zhuǎn)連翹苷對LPS作用的HK-2細(xì)胞活性、凋亡及氧化應(yīng)激的影響

1，2：實(shí)驗(yàn)3組、實(shí)驗(yàn)3+miR-146a inhibitor組圖3 抑制miR-146a可逆轉(zhuǎn)連翹苷對LPS作用的HK-2凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

連翹苷為連翹的主要化學(xué)成分之一，具有清熱、解毒、散結(jié)排膿等功效，長期用于治療風(fēng)熱感冒、發(fā)炎、淋病、丹毒和潰瘍〔10〕。研究顯示，連翹苷在急性肺損傷、AKI中具有潛在保護(hù)作用。Zhong等〔11〕研究顯示，連翹苷可顯著減輕LPS誘導(dǎo)的肺組織病理學(xué)改變，抑制肺泡出血、中性粒細(xì)胞浸潤及促炎細(xì)胞因子分泌，改善肺水腫。Zhang等〔12〕證實(shí)連翹苷可抑制活性氧產(chǎn)生、降低組織蛋白酶L和肝素酶在體內(nèi)外表達(dá)水平，抑制炎性細(xì)胞因子分泌進(jìn)而改善AKI小鼠腎臟功能。與上述保護(hù)作用一致，促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2之間的平衡是線粒體途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，Bax表達(dá)增加和Bcl-2表達(dá)降低可誘導(dǎo)線粒體膜孔形成，促進(jìn)凋亡蛋白釋放進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔13〕。氧化應(yīng)激在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起重要作用。本研究結(jié)果提示連翹苷可提高HK-2細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力進(jìn)而減輕LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

miRNA是轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，其通過與靶mRNA的序列特異性結(jié)合導(dǎo)致翻譯抑制或mRNA降解與心血管疾病、癌癥和腎臟疾病等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)〔14〕。研究顯示miR-146a表達(dá)降低與缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷〔15〕、肝缺血再灌注損傷〔16〕、LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷〔17〕有關(guān)。糖尿病腎病患者腎小球中miR-146a表達(dá)降低〔18〕。干擾肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MALAT)1表達(dá)通過上調(diào)miR-146a顯著抑制炎性細(xì)胞因子分泌和免疫反應(yīng)，增加細(xì)胞活力，減輕LPS誘導(dǎo)AKI〔19〕。此外，白藜蘆醇、雷公藤甲素通過上調(diào)miR-146a表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞BV2、HaCaT細(xì)胞的炎癥損傷具有保護(hù)作用〔20，21〕。本研究結(jié)果提示連翹苷對LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用可能與miR-146a增加有關(guān)。進(jìn)一步驗(yàn)證miR-146a功能顯示，過表達(dá)miR-146a顯著增加HK-2細(xì)胞活力，提高SOD、GSH活力，降低MDA含量，減弱LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡，與連翹苷的保護(hù)作用一致。此外，抑制miR-146a顯著降低20 ng/ml連翹苷預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的HK-2凋亡和氧化應(yīng)激損傷的影響。這說明連翹苷通過上調(diào)HK-2細(xì)胞中miR-146a表達(dá)進(jìn)而減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷。