尚夢(mèng)雅， 葉美萍， 閆靜敏， 龔偉明， 陸海空， 柴 喆， 戚騰飛， 倪立燕， 吳 娟， 周平玉

泌尿生殖道淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）和沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，CT）是常見(jiàn)的性傳播感染的病原體。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，衣原體和淋病的發(fā)病率為全球性傳播疾病第一和第二位，嚴(yán)重危害患者的心理和生殖健康[1]。

男性感染NG和CT后，部分患者臨床表現(xiàn)隱匿，癥狀輕微，需要通過(guò)采集尿道拭子確認(rèn)。由于尿道拭子采樣不易被患者接受，因而延誤早期診斷和治療，造成各種并發(fā)癥，如出現(xiàn)附睪炎、前列腺炎等，其精子的產(chǎn)生和質(zhì)量受到影響，導(dǎo)致不育[2-5]。隱匿性患者又成為感染重要傳染源。本研究通過(guò)收集上海市皮膚病醫(yī)院性病科門(mén)診男性患者的尿液和尿道拭子，應(yīng)用熒光探針PCR法檢測(cè)尿液樣本和尿道拭子中NG-DNA和CT-DNA，比較尿液及其不同部分與尿道拭子NG和CT的陽(yáng)性率和一致性，以選取檢出率較高的最佳樣本。并在不同時(shí)間段檢測(cè)分析尿液中NG-DNA和CTDNA及其穩(wěn)定時(shí)間，為今后大規(guī)模的樣本采集和保存提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

1.1.1 尿液 尿液標(biāo)本來(lái)自2021年1—4月就診于本院性病科門(mén)診男性患者。研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。患者均已知情同意。使用15 mL 無(wú)菌收集管留取患者尿液5～7 mL，加入等體積的樣本保存液，混勻后取2 mL移至EP管， -20 ℃凍存；余下尿混合液3 000×g離心5 min，將離心后的尿上清液分裝至EP管中，-20 ℃凍存；剩余的500 μL尿上清液與尿沉淀混勻后，-20 ℃凍存。應(yīng)用熒光探針PCR法檢測(cè)所有樣本中NGDNA 和CT-DNA。

1.1.2 尿道拭子 使用2支無(wú)菌拭子于男性尿道口內(nèi)2～3 cm處捻轉(zhuǎn)數(shù)次取出，將一根拭子頭浸入裝有1 mL 生理鹽水的標(biāo)本管，應(yīng)用熒光探針PCR法檢測(cè) NG-DNA和CT-DNA。另一根拭子頭接種于MTM瓊脂平板中于35 ℃、5% CO2進(jìn)行48～72 h的NG培養(yǎng)。

1.1.3 試劑 CT和NG核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)?，上?？迫A生物工程股份有限公司），MTM瓊脂平板（上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司），樣本保存液（北京天根科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 熒光探針PCR檢測(cè)方法 按NG和CT核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作：各取100 μL 尿液、尿沉淀、尿上清液、尿道拭子浸潤(rùn)后的生理鹽水檢測(cè)樣本和100 μL樣本處理液A，混勻，13 000 r/min， 10 min離心；吸棄A液處理后的上清液，加入50 μL 樣本處理液B，振蕩混勻后，100 ℃干浴 10 min；分別取2 μL B液處理后的上清液作為PCR反應(yīng)模板加入28 μL NG或CT的PCR反應(yīng)液進(jìn)行DNA擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件設(shè)置為：50 ℃ UNG酶處理2 min，93 ℃預(yù)變性2 min，93 ℃變性10 s，60 ℃退火、延伸及檢測(cè)熒光30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，應(yīng)用ABI 7500熒光PCR儀器軟件進(jìn)行分析，樣本循環(huán)域值（cycle threshold，Ct）≤37為陽(yáng)性結(jié)果，Ct≥40或無(wú)數(shù)值為陰性結(jié)果，若37＜Ct＜40則進(jìn)行復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)結(jié)果＜40為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料之間比較采用χ2檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)。χ2檢驗(yàn)以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kappa值≥0.75，兩種方法一致性較好；0.4≤ Kappa值＜0.75，兩種方法一致性一般；若Kappa值＜0.4，兩種方法一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 NG-DNA檢測(cè)結(jié)果

熒光探針PCR法檢測(cè)尿道拭子樣本NG-DNA陽(yáng)性率為25.2%（37/147），尿液沉渣NG-DNA陽(yáng)性率為24.5%（36/147），兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.02，P=0.89）。見(jiàn)表1。尿沉渣NG-DNA陽(yáng)性率高于尿液和尿上清液，但三者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以尿道拭子NG-DNA陽(yáng)性為對(duì)照，尿沉渣用于檢測(cè)NG-DNA的靈敏度和特異度分別為83.8%（31/37）和95.5%（105/110），檢測(cè)結(jié)果符合率為92.5%（136/147），且一致性較好（Kappa=0.8，P＜0.01）。

表1 尿道拭子與尿液、尿沉渣及尿上清中NG-DNA的結(jié)果比較Table 1 Prevalence rate of NG-DNA detected with urethral swab, urine, urine sediment, and urine supernatant

尿道拭子樣本NG培養(yǎng)的陽(yáng)性率為15.0%（22/147）。熒光探針PCR法檢測(cè)尿道拭子和尿液樣本NG-DNA的陽(yáng)性率均高于培養(yǎng)法，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 熒光探針?lè)ê团囵B(yǎng)法檢測(cè)NG的結(jié)果比較Table 2 Prevalence of Neisseria gonorrhoeae detected by bacteriological culture and fluorescence probe PCR with urine or urethral swab

2.2 CT-DNA 檢測(cè)結(jié)果

熒光探針PCR法檢測(cè)尿道拭子CT-DNA陽(yáng)性率為9.5%（14/147），尿液樣本CT-DNA陽(yáng)性率為10.9%（16/147），兩者的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.15，P=0.70）。尿液和尿沉渣中CT-DNA陽(yáng)性率一致，且均高于尿上清液，但三者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以尿道拭子CT-DNA陽(yáng)性為對(duì)照，尿沉渣CT-DNA檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和特異度分別為85.7%（12/14）和97.0%（129/133），檢測(cè)結(jié)果符合率為95.9%（141/147），且一致性較好（Kappa=0.78，P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 尿道拭子與尿液、尿沉渣及尿上清中CT-DNA的結(jié)果比較Table 3 Positive rate comparison of CT-DNA from urethral swabs and different components of urine

2.3 尿液中NG-DNA和CT-DNA的穩(wěn)定時(shí)間

選取尿道拭子和尿液NG-DNA均為陽(yáng)性的尿液20份和CT-DNA均為陽(yáng)性的尿液7份，放置4℃條件下，按照表4中不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)NG-DNA和CT-DNA的穩(wěn)定性。NG-DNA在14 d的陽(yáng)性率降至65.0%，CT-DNA陽(yáng)性率在22 d降至50.0%，結(jié)果顯示：在4℃下，尿液中NG-DNA穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)11 d，CT穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)達(dá)18 d，為此類(lèi)樣本的運(yùn)輸、集中檢測(cè)的可行性提供了客觀依據(jù)。

表4 4℃條件下不同時(shí)間段尿液中NG和CT檢出率Table 4 Stability of NG and CT detection with urine samples stored at 4℃ over time （%）

3 討論

相比于尿道拭子，尿液樣本的采集具有簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，更易被患者接受。目前，相較于尿道拭子，尿液樣本用于男性泌尿道NG和CT檢測(cè)的優(yōu)劣性研究數(shù)據(jù)較少。

本研究首先采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法及熒光探針PCR法比較了尿道拭子中NG檢出率，結(jié)果顯示培養(yǎng)法的陽(yáng)性率僅為15.0%，顯著低于熒光探針PCR法的陽(yáng)性率25.2%（37/147）。核酸擴(kuò)增方法具有靈敏度高、快速檢測(cè)、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，因此在臨床中被廣泛應(yīng)用[6]，甚至出現(xiàn)核酸擴(kuò)增法取代培養(yǎng)法的趨勢(shì)。然而，培養(yǎng)法仍是NG檢測(cè)的經(jīng)典方法，而且目前只有基于培養(yǎng)法獲得的抗菌藥物敏感性結(jié)果，才能在臨床上合理選擇抗菌藥物，延緩耐藥菌形成和傳播，而核酸擴(kuò)增法缺乏這方面的優(yōu)勢(shì)。因此，臨床上NG培養(yǎng)法聯(lián)合核酸擴(kuò)增法對(duì)淋病的診治和防控具有重要作用，一方面可以避免抗菌藥物不合理使用造成細(xì)菌耐藥加劇，另一方面可以防止患者因漏診而造成嚴(yán)重后遺癥[7-8]。

本研究應(yīng)用熒光探針PCR法進(jìn)行NG-DNA和CT-DNA檢測(cè)，比較尿道拭子和尿液樣本中NG和CT陽(yáng)性率及結(jié)果一致性。結(jié)果顯示尿道拭子和尿液樣本的NG-DNA檢測(cè)結(jié)果一致性較好，尿液樣本NG-DNA檢測(cè)的靈敏度和特異度分別為83.8%和95.5%，其靈敏度稍低于相關(guān)的研究數(shù)據(jù)[9-10]，可能與檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用有關(guān)。尿道拭子和尿液CT-DNA檢測(cè)結(jié)果一致性較好，尿液樣本CT-DNA的檢測(cè)陽(yáng)性率高于尿道拭子，但結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。尿液樣本CT-DNA檢測(cè)的靈敏度和特異度分別為85.7%和97.0%，與文獻(xiàn)報(bào)道的應(yīng)用核酸擴(kuò)增法檢測(cè)尿液樣本CT-DNA的靈敏度和特異度相仿[9-10]。

為進(jìn)一步研究在尿液不同部分樣本中NG和CT的檢出率，將尿液高速離心后，獲得尿沉渣和尿上清液兩部分。細(xì)胞、管型以及病原微生物等物質(zhì)沉積于尿沉渣中，使其病原體載量高于未分離尿液。研究表明，尿沉渣可以進(jìn)行NG培養(yǎng)[11]，并且酶聯(lián)免疫法檢測(cè)尿沉渣中NG的靈敏度高于尿液[12]。本研究采用熒光探針PCR法對(duì)尿液不同部分進(jìn)行NG-DNA和CT-DNA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)尿沉渣中NG檢出率高于尿液和尿上清液；尿液和尿沉渣中CT檢出率相似，均高于尿上清液。因此，建議臨床選擇尿沉渣檢測(cè)NG-DNA和CT-DNA，以提高檢出率。

本研究進(jìn)一步探討尿液中NG-DNA和CTDNA的穩(wěn)定時(shí)間，其中尿液中NG-DNA穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)達(dá)11 d，CT-DNA穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)達(dá)18 d，為尿液樣本的保存和運(yùn)輸提供科學(xué)數(shù)據(jù)。尿液是一種自我收集的樣本，對(duì)無(wú)法采集尿道拭子的高危人群，可院內(nèi)或院外收集尿液進(jìn)行NG和CT的檢測(cè)。院外或外地收集的尿液樣本可通過(guò)郵寄方式進(jìn)行NG和CT檢測(cè)[7,13]，NG-DNA和CT-DNA在尿液中的穩(wěn)定性為長(zhǎng)時(shí)間郵寄和大規(guī)模收集樣本提供可能。并且與院內(nèi)樣本采集相比，院外采集尿液不受時(shí)間和地點(diǎn)限制，可避免醫(yī)院內(nèi)樣本交叉污染。

樣本采集的便捷、無(wú)創(chuàng)、易得性一直是臨床采集樣本的目標(biāo)，其不僅容易被患者接受，也為今后大規(guī)模的人群篩選提供可能。近年來(lái)，有關(guān)“便捷、無(wú)創(chuàng)、易得”的生物樣本在感染性疾病研究中時(shí)有報(bào)道，如唾液和尿液等無(wú)創(chuàng)樣本可用于梅毒、埃博拉病毒感染以及登革熱等感染性疾病的診斷[14-16]。本研究表明尿液樣本用于檢測(cè)NG和CT具有較高的靈敏度和特異度，尿液可替代臨床尿道拭子作為檢測(cè)男性泌尿生殖道NG和CT的樣本，其中尿沉渣是最佳樣本選擇。