馬軍偉,王 佳,宋 煒

延安大學附屬醫(yī)院腫瘤科，陜西延安 716000

食管癌是常見的上消化道腫瘤之一。目前，上消化道腫瘤是我國城市人口惡性腫瘤的重要死亡原因，同時也是世界范圍內相對常見、多發(fā)的惡性腫瘤之一，其病因與吸煙、職業(yè)、環(huán)境、電離輻射等有關[1-2]。近年來，雖然人類對食管癌的研究加深，但截至目前其發(fā)病機制尚未完全弄清。分泌型卷曲相關蛋白1(SFRP1)和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是機體中的相對常見的2種生物學因子，在各種疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸過程中均發(fā)揮了重要作用[3]。SFRP1作為一種新發(fā)現(xiàn)的候選抑癌基因，在人類的多種腫瘤包括上消化道腫瘤中均存在表達下調或缺失的現(xiàn)象[4]，而其失活的原因則可能與上消化道腫瘤的子區(qū)高甲基化被啟動有關。β-catenin是CTNNB1基因編碼的蛋白，可與鈣黏蛋白、α-catenin共同組成黏附連接復合體。既往研究顯示，β-catenin可作為信號分子介導細胞黏附和信號傳導[5]。一項Meta分析顯示，β-catenin在肝癌、腸癌、胃癌等疾病中起重要作用，與食管癌的不良預后、疾病進展及腫瘤侵襲性均密切相關[6]。本研究選取本院腫瘤科收治的121例食管癌患者作為研究對象，探討SFRP1、β-catenin在該病中的作用及其相關機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院腫瘤科2014年1月至2018年1月收治的121例食管癌患者作為研究對象進行前瞻性研究。納入標準：(1)符合中國抗癌協(xié)會食管癌專業(yè)委員會《食管癌規(guī)范化診療指南(2013版)》[7]中食管癌診斷標準；(2)活檢標本滿足診斷要求；(3)知情同意并簽署知情同意書；(4)臨床資料完整。排除標準：(1)食管癌合并其他惡性病變；(2)病理學檢查時有放化療、生物免疫治療史；(3)治療期間死亡、轉院、失訪。121例食管癌患者中男78例，女43例；鱗癌51例，腺癌70例；腫瘤分化程度：高分化31例，中分化62例，低分化28例；癌轉移53例，未轉移68例。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)聯(lián)合制定的標準[8]，將121例食管癌患者分成Ⅰ期28例，Ⅱ期41例，Ⅲ期37例及Ⅳ期15例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準后執(zhí)行。

1.2儀器與試劑 儀器：細胞質分析儀[亞德諾半導體技術(上海)有限公司]；全自動免疫組化檢測儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]等。試劑：鼠抗人SFRP1(ELISA)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，規(guī)格：96T/49T)；鼠抗人β-catenin單克隆抗體(北京中山生物技術有限公司，型號：CAT-5H10)等。

1.3方法

1.3.1標本采集 操作者均為本院經(jīng)驗豐富的檢驗科醫(yī)生，對本課題不知情，也不了解A、B組受試者的基線資料，采用單盲法判斷。采集所有受試者癌組織及癌旁組織標本，均于標本離體后0.5 h內取材，并分成2份：一份放置于-80 ℃低溫冰箱保存，用于DNA提取；一份石蠟包埋，采用常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色法染色，用于免疫組織化學法(IHC) β-catenin檢測。

1.3.2檢測步驟 分別采用甲基化特異性PCR(MSP)和免疫組織化學法(IHC)檢測癌組織及癌旁組織SFRP1、β-catenin水平。SFRP1檢測：提取癌組織及癌旁組織標本，提取DNA，采用細胞質分析儀檢測。β-catenin檢測：(1)癌組織及癌旁組織標本均采用中性福爾馬林脫水固定；(2)常規(guī)石蠟包埋和水化，接著用枸櫞酸鈉緩沖液(陜西興邦藥業(yè)有限公司，國藥準字H61022282)煮沸后孵育10 min，加一抗4 ℃孵育過夜；(3)加生物素標記的二抗處理后再次孵育10 min，用蘇木素復染，乙醇脫水，切片，然后用二甲苯透明中性樹膠(南京森貝伽生物科技有限公司，編號：SBJ0126)封片；(4)采用全自動免疫組化檢測儀進行檢測。

1.3.3SFRP1、β-catenin結果判定 SFRP1結果判定每張切片隨機選取10個高倍鏡(×40)視野，計算陽性細胞百分數(shù)。陰性：腫瘤陽性細胞數(shù)<10%；陽性：陽性表達定位于細胞質，細胞質有棕黃色顆粒，腫瘤陽性細胞數(shù)≥10%。

1.3.4β-catenin結果判定 陽性細胞百分數(shù)與SFRP1的判定結果相同。陰性：染色結果無著色或單純細胞質著色；陽性：呈棕黃色顆粒狀，主要位于細胞膜。

2 結 果

2.1癌組織及癌旁組織SFRP1、β-catenin表達水平比較 食管癌癌組織SFRP1表達水平較癌旁組織明顯降低，β-catenin表達水平較癌旁組織明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織及癌旁組織SFRP1、β-catenin表達水平比較

2.2不同臨床病理特征食管癌患者SFRP1、β-catenin表達陽性率比較 是否淋巴結轉移食管癌患者SFRP1表達陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，β-catenin表達陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同病理類型、分化程度、TNM分期食管癌患者SFRP1、β-catenin表達陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 SFRP1、β-catenin表達與食管癌的臨床病理特征的關系(n)

3 討 論

既往研究證實，SFRP1在胚胎發(fā)育階段主要參與腦、血管等重要系統(tǒng)的細胞分化[9]，但當其成體后，存在于機體的諸多組織中。作為一種重要的抑制因子，SFRP1的作用多集中在Wnt信號(配體蛋白質Wnt和膜蛋白受體結合激發(fā))上游，有研究證實，雖然其在正常狀態(tài)下對抵抗食管癌發(fā)生和發(fā)展、促進細胞凋亡等[10]生物過程均極有幫助，但若超過其臨界值時，則會損傷機體組織。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，食管癌患者癌組織中SFRP1的表達水平低于癌旁組織(P<0.05)，而不同病理類型、分化程度、TNM分期、是否淋巴結轉移食管癌患者SFRP1蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結合文獻[10-12]及本研究結果，SFRP1在食管癌中的作用機制可能與以下幾點有關：(1)SFRP1參與Wnt信號轉導而對食管癌發(fā)生有影響。通常情況下，Wnt信號轉導在成體組織細胞中的作用主要是協(xié)助細胞增殖，但若機體受損時，這條信號通路中的關鍵蛋白突變，導致Wnt信號活化出現(xiàn)異常，繼而參與腫瘤發(fā)生。(2)SFRP1基因的第1個外顯子周圍有高密度的CpG島，其是發(fā)生甲基化的重要區(qū)域。有研究顯示，當機體中的SFRP1基因甲基化后Wnt信號通路則會被激活，繼而導致本途徑中的β-catenin在細胞質內累積、轉移或與該途徑中的某些轉錄因子結合[12]。而在這種情況下，靶基因的轉錄和表達也會隨著被刺激，繼而參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。(3)SFRP1可與Fra相互競爭而使Wnt信號通路被抑制。有研究發(fā)現(xiàn)，SFRP1利用部分類似氨基端序列結構與Wnt蛋白結合，進而抑制Wnt信號通路[13]。本研究中食管癌癌組織SFRP1陽性表達率明顯低于癌旁組織，提示SFRP1表達降低會抑制Wnt信號轉導，促進腫瘤細胞增殖。

作為一種細胞質蛋白，β-catenin主要分布于胞膜，可與E-鈣黏蛋白(E-cadherin)相結合而形成的一種E-cadherin-β-catenin復合物。這種復合物在許多細胞反應中發(fā)揮重要作用，有研究證實β-catenin變異均會引起許多人類腫瘤，如結腸癌、肺癌[14-15]。正常情況下，腫瘤抑制(APC)基因對機體細胞中的β-catenin有較好的調節(jié)，促使β-catenin基因出現(xiàn)特殊片段磷酸化。然而，當β-catenin或APC基因突變時，細胞內的β-catenin水平隨之遞增，而其部分則會從胞膜上轉移至胞核內聚集。本研究結果顯示，β-catenin在食管癌癌組織中的表達較癌旁組織明顯升高(P<0.05)。這表明β-catenin在食管癌病變組織呈高表達[16]，而癌旁組織陽性率較低，嚴重影響食管癌患者的預后生存率。通常情況下，β-catenin主要分為兩類，一類是游離型β-catenin，二類是結合型β-catenin。有研究證實，前者主要表達于食管癌細胞的細胞核中，是重要的靶基因，Wnt信號通路則是它與轉錄因子Tcf/Lef結合后形成的；后者的主要功能是調節(jié)細胞黏附功能，但無法進入細胞核，而這種調節(jié)功能還必須與其他細胞因子結合才可實現(xiàn)[17]。食管癌的發(fā)生則主要與游離型β-catenin相關，而導致這種現(xiàn)象的原因在于β-catenin降低了轉錄因子的轉錄活性，而使Wnt信號通路被激活，使信號轉導途徑異常而過度調節(jié)食管癌細胞的增殖[18]。因此，推測SFRP1與β-catenin之間還存在某種聯(lián)系，但具體機制有待進一步研究。

綜上所述，SFRP1低表達、β-catenin高表達可能是食管癌高發(fā)的主要誘因之一，二者主要通過相同的媒介物質Wnt信號通路導致食管癌的發(fā)生。SFRP1、β-catenin均在食管癌的發(fā)生、發(fā)展、轉歸及預后中發(fā)揮重要作用，可將其作為食管癌發(fā)生的早期腫瘤標志物。