茍海梅，陳 瑩，徐 磊，李九龍，郭曉蘭，，鐘曉武，△

1．川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川南充 637000；2． 川北醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，四川南充 637000； 3．川北醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，四川南充 637000；4．南充市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川南充 637100

痛風(fēng)是機(jī)體嘌呤代謝紊亂、血尿酸水平持續(xù)升高而導(dǎo)致單鈉尿酸鹽(MSU)晶體析出并沉積于組織或器官而引起反復(fù)發(fā)作性炎性疾病[1]。近年來，隨著生活水平不斷提高，痛風(fēng)的發(fā)病率逐年呈上升趨勢，已成為臨床常見病、多發(fā)病，且痛風(fēng)發(fā)病年齡有向低齡化發(fā)展趨勢[2]。MSU晶體的沉積是痛風(fēng)發(fā)生的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，但痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制及炎癥自限的確切分子機(jī)制尚未完全闡明，仍是目前亟待解決的問題。

微小RNA(miRNA)是一類由22～24 個(gè)核苷酸組成的高度保守性內(nèi)源性非編碼小RNA，它通過與mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)特異性結(jié)合降解靶mRNA和(或)抑制靶mRNA的表達(dá)及翻譯，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3]。多項(xiàng)研究表明，miRNA在痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制中有關(guān)鍵性調(diào)控作用[4-6]。miR-27a在骨性關(guān)節(jié)炎[7]及系統(tǒng)性紅斑狼瘡[8]中均表達(dá)異常呈下調(diào)趨勢，提示miR-27a與炎性反應(yīng)負(fù)調(diào)控相關(guān)。已有研究表明，miR-27a在痛風(fēng)患者中存在異常表達(dá)，其可能作為炎癥負(fù)性調(diào)控因子參與痛風(fēng)的炎癥免疫反應(yīng)[9]，但其與痛風(fēng)發(fā)生相關(guān)的確切靶分子機(jī)制尚不清楚。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法預(yù)測miR-27a作用的靶基因，對其靶基因進(jìn)行GO富集分析、KEGG信號通路富集分析，為痛風(fēng)炎癥免疫反應(yīng)研究提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1一般資料 將川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的20例男性原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(PGA)患者納入PGA組，將20例體檢健康男性納入健康對照組。其中，PGA組平均年齡(44.30±13.27)歲，健康對照組平均年齡(47.70±12.65)歲，兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1miRNA檢測 采用人外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)蠊?對人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行分離，并用Trizol試劑盒(美國 Invitrogen公司)一步法提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，同時(shí)用紫外分光光度儀進(jìn)行濃度測定。采用TaqMan MicroRNA Assays 試劑盒(美國Life Technologies公司)將miR-27a逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增及熒光檢測，以 U6為內(nèi)參，嚴(yán)格按照說明書指示完成檢測操作。采用2-ΔΔCt法分析miRNA的相對表達(dá)量。

1.2.2miR-27a在人類基因組中的位置及保守性分析 應(yīng)用UCSC基因組在線軟件工具(http://genome.ucsc.edu/)分析miR-27a在人類基因組中的位置，查找不同物種間的成熟序列并分析其保守性。

1.2.3miR-27a靶基因篩選 應(yīng)用TargetScan (http://www.targetscanorg/)數(shù)據(jù)庫，miRDB(http://mirdb.org/)數(shù)據(jù)庫和RNA22(https://cm.jefferson.edu/rna22/precomputed/)數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測 miR-27a 靶基因，同時(shí)運(yùn)用GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)查詢與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)的疾病基因。為了增加預(yù)測結(jié)果的可靠性，將4種數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果取交集作為與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)的miR-27a靶基因。

1.2.4miR-27a靶基因的功能注釋 應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對miR-27a預(yù)測靶基因集合進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析包括生物過程、細(xì)胞組分和分子功能。

2 結(jié) 果

2.1miR-27a在人類基因組中的位置及保守性分析 應(yīng)用UCSC基因組在線軟件獲取miR-27a在人類基因組中的位置(圖1)，miR-27a定位于人類19q13.12染色體上chr19:13 836 440-13 836 517位置，長度共78 bp，其核苷酸序列在人、黑猩猩、大猩猩、獼猴、狒狒、小鼠、狗、大象物種中呈高度保守。

圖1 miR-27a 在基因組中的位置和保守性分析

2.2miR-27a 在PGA患者中的表達(dá) 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測PGA組和健康對照組PBMC中miR-27a的相對表達(dá)水平，結(jié)果顯示，miR-27a在PGA組患者中的相對表達(dá)水平明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-27a 在PGA組和健康對照組中的表達(dá)水平

2.3篩選與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)的miR-27a靶基因 應(yīng)用TargetScan、miRDB和RNA22數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測miR-27a的靶基因，然后對miR-27a靶基因結(jié)果取交集，共得到 585個(gè)潛在調(diào)控靶基因。此外，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中查詢與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)基因共980個(gè)基因。將GeneCards數(shù)據(jù)庫所得基因與585個(gè)潛在調(diào)控靶基因再次取交集，最終得到MAPK14、RFX3、ABCA1、HS2ST1、ENPEP和CACNA2D3等共33個(gè)與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)的miR-27a靶基因。見圖3。

2.4預(yù)測靶基因的GO富集分析 對與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)的miR-27a靶基因進(jìn)一步進(jìn)行GO富集分析，GO富集分析結(jié)果顯示：miR-27a的靶基因顯著富集到生物過程調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程調(diào)節(jié)、有機(jī)物代謝過程、多細(xì)胞生物過程、生物過程正調(diào)控、對外界刺激的反應(yīng)、主要代謝調(diào)節(jié)等多個(gè)生物學(xué)過程中；富集到質(zhì)膜的外側(cè)、細(xì)胞表面、血影蛋白細(xì)胞骨架及細(xì)胞膜的細(xì)胞組分；富集有機(jī)環(huán)化合物結(jié)合、蛋白結(jié)合、催化活性、離子結(jié)合等分子功能。見表1。

圖3 miR-27a靶基因預(yù)測

2.5預(yù)測靶基因的KEGG信號通路分析 對與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)的miR-27a靶基因進(jìn)一步進(jìn)行KEGG功能富集分析，KEGG信號通路分析顯示，miR-27a的靶基因顯著富集于MAPK信號通路、癌癥相關(guān)通路、Rap1信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、干細(xì)胞多能性調(diào)節(jié)信號通路、青少年成人起病型糖尿病通路和醛固酮控制的鈉鹽重吸收通路。見表2。

表1 miR-27a 預(yù)測靶基因 GO 富集分析結(jié)果

續(xù)表1 miR-27a 預(yù)測靶基因 GO 富集分析結(jié)果

表2 miR-27a預(yù)測靶基因 KEGG 信號通路分析

3 討 論

miRNA作為調(diào)控分子，可同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因，參與生物體細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，從而對細(xì)胞特定功能和表型進(jìn)行有效調(diào)控，發(fā)揮生物學(xué)功能[3]?，F(xiàn)有研究表明，miRNA與免疫功能失調(diào)、多種慢性炎癥或自身免疫病等相關(guān)[10-11]。通過UCSC基因組在線軟件分析，miR-27a核苷酸序列在多個(gè)物種中呈高度保守，提示其發(fā)生突變的概率低，有潛在的重要生物學(xué)功能。本研究對PGA組和健康對照組中miR-27a基因表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)在PGA組中miR-27a基因表達(dá)水平較健康對照組明顯降低，與李寧寧等[9]研究結(jié)果一致，進(jìn)一步提示miR-27a可能作為炎癥負(fù)性調(diào)控因子在痛風(fēng)的炎癥免疫反應(yīng)過程中起到重要作用。

為進(jìn)一步分析miR-27a參與痛風(fēng)炎癥免疫反應(yīng)相關(guān)的靶分子機(jī)制，準(zhǔn)確預(yù)測其靶基因，本研究運(yùn)用TargetScan、RNA22和miRDB 3個(gè)使用較多的靶基因預(yù)測軟件，取3個(gè)軟件共同預(yù)測的靶基因作為結(jié)果，利用不同軟件、不同算法從多角度分析，以增強(qiáng)預(yù)測結(jié)果的可靠性。本研究再將生物信息學(xué)方法預(yù)測的靶基因和 GeneCards數(shù)據(jù)庫中與痛風(fēng)相關(guān)的基因聯(lián)合分析，取交集最終得到MAPK14、RFX3、ABCA1、HS2ST1、ENPEP、CACNA2D3等33個(gè)潛在的靶基因。MAPK14(即p38α)是p38MAPK最重要的亞型之一，p38MAPK信號通路與炎性反應(yīng)調(diào)控密切相關(guān)。有研究顯示，p38MAPK信號通路參與調(diào)控MSU誘導(dǎo)的單核細(xì)胞IL-8表達(dá)，進(jìn)而參與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎性反應(yīng)[12]。在中國人群全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)研究中發(fā)現(xiàn)，RFX3是中國人群特有的原發(fā)性痛風(fēng)易感基因[13]。RFX3由胰島β細(xì)胞分泌，可結(jié)合到葡萄糖激酶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控其表達(dá)，從而影響胰島β細(xì)胞的功能[14]。胰島β細(xì)胞主要參與血糖的調(diào)節(jié)，糖代謝的紊亂不僅直接影響嘌呤的代謝及尿酸的合成，而且影響尿酸的排泄[15]。因此，RFX3突變可能引起胰島β細(xì)胞功能缺陷，從而直接或間接引起高尿酸血癥和痛風(fēng)。

GO富集分析表明，miR-27a靶基因存在細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)及對外界刺激的反應(yīng)等多種生物學(xué)功能。痛風(fēng)屬于代謝性風(fēng)濕病范疇，與嘌呤代謝紊亂及尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥相關(guān)，高尿酸血癥所致的MSU沉積可作為外界刺激反復(fù)引起炎性反應(yīng)。KEGG通路富集分析顯示，miR-27a可能通過調(diào)控MAPK信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和醛固酮控制的鈉鹽重吸收通路等發(fā)揮生物學(xué)功能。MAPK信號通路是一類蘇氨酸蛋白激酶，可以被細(xì)胞外信號或刺激等激活，包括ERK1/2 MAPK、JNK MAPK、p38MAPK等活化途徑。目前研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2 MAPK、JNK MAPK和p38MAPK通路可誘導(dǎo)前炎癥細(xì)胞因子IL-8的產(chǎn)生，且參與調(diào)控MSU誘導(dǎo)的單核細(xì)胞IL-8表達(dá)[14，16-17]。在體外MSU誘導(dǎo)的單核細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞趨化活性90%來自IL-8，而大量中性粒細(xì)胞浸潤到關(guān)節(jié)腔并介導(dǎo)炎性反應(yīng)是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的核心病理機(jī)制[14]。MAPK14是miR-27a預(yù)測靶基因，故筆者推測痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎經(jīng)MSU刺激后，miR-27a基因表達(dá)水平降低，且作為炎癥負(fù)性調(diào)控因子靶向作用于MAPK14，MAPK14在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎呈高表達(dá)，MAPK14經(jīng)p38MAPK通路誘導(dǎo)單核細(xì)胞IL-8表達(dá)，IL-8激活中性粒細(xì)胞并浸潤到關(guān)節(jié)腔介導(dǎo)痛風(fēng)炎性反應(yīng)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，IL-1、IL-8、IL-10等細(xì)胞因子在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[14]，miR-27a參與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，因此miR-27a可能通過細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用參與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制。醛固酮控制的鈉鹽重吸收系統(tǒng)失衡會(huì)引起腎臟的損傷，進(jìn)而影響嘌呤的代謝及尿酸的合成，而且影響尿酸的排泄，miR-27a也可能通過參與醛固酮控制的鈉鹽重吸收直接或間接引起高尿酸血癥和痛風(fēng)。

本研究通過生物信息學(xué)分析挖掘miR-27a在痛風(fēng)炎癥免疫反應(yīng)相關(guān)的靶分子機(jī)制，結(jié)果表明miR-27a可能通過調(diào)控多個(gè)與痛風(fēng)發(fā)病相關(guān)的靶基因，影響多條信號通路的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，從而參與痛風(fēng)炎癥免疫反應(yīng)機(jī)制，進(jìn)一步為miR-27a調(diào)控痛風(fēng)炎癥免疫反應(yīng)機(jī)制及痛風(fēng)治療靶點(diǎn)提供了新的依據(jù)。