劉靖 劉明學(xué) 楊振宇 蘇毅 紀(jì)延輝 覃宇冰 黃文倩 何朝升 黃桂珍 楊國(guó)柱 胡增隆

1廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廈門 361003；2廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒外科，廈門 361003

腎盂輸尿管連接部梗阻（ureteropelvic junction obstruction，UPJO）所致腎積水是小兒外科常見病。其中，先天性腎盂輸尿管連接部（ureteropelvic junction，UPJ）狹窄占UPJO的絕大部分。明確UPJ狹窄的病因及發(fā)病機(jī)制對(duì)預(yù)防UPJO具有重要意義。我們前期利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了胎鼠腎積水的發(fā)生機(jī)制［1-2］。本研究擬在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)先天性UPJ狹窄患兒狹窄段輸尿管組織及鄰近的正常輸尿管組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，期望應(yīng)用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)先天性UPJ狹窄的病因及發(fā)病分子機(jī)制進(jìn)行探索。

材料與方法

一、研究對(duì)象

研究對(duì)象為廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院2017年1月至2019年12月的30例因先天性UPJO行Anderson-Hynes術(shù)的患兒，男17例，女13例；左側(cè)24例，右側(cè)6例；年齡（35.7±7.9）個(gè)月。

本研究接受廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的指導(dǎo)和監(jiān)督，參與研究的患兒監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合UPJO診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡1個(gè)月至14歲；③單側(cè)或雙側(cè)UPJO，需手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合診斷及納入標(biāo)準(zhǔn)；②合并其他泌尿系統(tǒng)畸形、伴有輸尿管多段狹窄的UPJO；③術(shù)中發(fā)現(xiàn)伴UPJ瓣膜、高位輸尿管開口、迷走血管壓迫UPJ、輸尿管上段扭曲。本研究經(jīng)廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過（倫理審批號(hào)：KY-2019-011）。

二、實(shí)驗(yàn)分組及組織標(biāo)本的處理

留取手術(shù)后新鮮腎盂輸尿管連接部組織，取狹窄段輸尿管標(biāo)本0.5 g作為實(shí)驗(yàn)組（A組，n=30），取與狹窄段遠(yuǎn)端鄰近的正常輸尿管組織標(biāo)本0.5 g作為對(duì)照組（B組，n=30）。無(wú)菌狀態(tài)下以生理鹽水反復(fù)清洗后，立即保存于-80℃冰箱備用。

三、TMT相對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

（一）蛋白質(zhì)提取和肽段酶解

將A、B兩組各30份標(biāo)本混合在一起提取的蛋白質(zhì)分別作為A、B兩組的蛋白質(zhì)樣品。蛋白質(zhì)提取采用SDT裂解法，蛋白質(zhì)定量采用BCA法。每個(gè)樣品取適量蛋白質(zhì)用于胰蛋白酶酶解和肽段定量（OD280）［3］。

（二）TMT標(biāo)記

每份樣品取100μg肽段，根據(jù)TMT標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書（Thermo公司）進(jìn)行標(biāo)記。

（三）高pH反相肽段分級(jí)

等量混合每組標(biāo)記后肽段，肽段分級(jí)采用高pH反相肽分離試劑盒。經(jīng)柱平衡、上樣、脫鹽、梯度洗脫后，每份洗脫的肽段樣品予真空干燥、復(fù)溶、測(cè)定肽段濃度。

（四）液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集

采用高效液相色譜系統(tǒng)Easy nLC對(duì)樣品進(jìn)行分離，質(zhì)譜分析采用Q-Exactive質(zhì)譜儀。

（五）蛋白質(zhì)鑒定和定量分析

質(zhì)譜分析所使用的原始數(shù)據(jù)為RAW格式文件，查庫(kù)鑒定及定量分析所采用的軟件為Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4。

（六）生物信息學(xué)分析

①GO功能注釋：對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合的GO注釋采用Blast2GO（https://www.blast2go.com/）。②KEGG通路注釋：目標(biāo)蛋白質(zhì)集合的KEGG通路注釋采用KAAS（KEGGAutomatic Annotation Server）軟件。③GO注釋和KEGG注釋的富集分析：對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行GO注釋的富集分析或KEGG通路注釋的富集分析。④聚類分析：首先歸一化處理目標(biāo)蛋白質(zhì)集合的定量信息，然后采用Complexheatmap R軟件包對(duì)樣品和蛋白質(zhì)的表達(dá)量進(jìn)行分類，生成層次聚類熱圖。⑤PPI網(wǎng)絡(luò)分析：分析目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，利用STRING（http://string-db.org/）中的信息進(jìn)行查找，并使用Cyto-Scape軟件生成相互作用網(wǎng)絡(luò)。

四、目標(biāo)蛋白PRM定量分析

（一）樣品制備

①蛋白提?。翰捎肨MT實(shí)驗(yàn)制備完的樣品。②蛋白酶解：每例樣品取約200μg蛋白進(jìn)行酶解，酶解后的肽段脫鹽凍干、復(fù)溶、測(cè)定肽段濃度（OD280）。

（二）LC-PRM/MS檢測(cè)分析

①高效液相色譜：按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)鑒定得到的9種目標(biāo)蛋白的16條肽段進(jìn)行PRM定量分析。將肽段信息導(dǎo)入Xcalibur軟件中進(jìn)行PRM方法設(shè)置。每例樣品分別取1μg肽段，摻入20 fmol標(biāo)肽執(zhí)行檢測(cè)。運(yùn)用高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行色譜分離。②高分辨質(zhì)譜PRM/MS分析：用Q-Exactive HF質(zhì)譜儀對(duì)高效液相色譜分離后的樣品進(jìn)行PRM質(zhì)譜分析。對(duì)6份（A、B兩組每組各3份）樣品分別進(jìn)行PRM檢測(cè)，最后利用Skyline 3.5.0軟件對(duì)PRM原始文件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

結(jié) 果

一、手術(shù)情況

30例UPJO患兒均成功完成Anderson-Hynes術(shù)。術(shù)中證實(shí)腎積水均為UPJ狹窄所致，不伴有UPJ瓣膜、高位輸尿管開口、迷走血管壓迫及輸尿管上段扭曲。

二、差異表達(dá)蛋白篩選

兩組標(biāo)本共鑒定出蛋白6 093種，篩選出差異蛋白160種。A組與B組比較，表達(dá)上調(diào)的蛋白有65種，表達(dá)下調(diào)的蛋白有95種。前10種顯著上調(diào)的蛋白是SWI/SNF-related matrix-associated actindependent regulator of chromatin subfamily E member 1-related（染色質(zhì)亞家族E成員1相關(guān)的SWI/SNF相關(guān)基質(zhì)相關(guān)肌動(dòng)蛋白依賴性調(diào)節(jié)劑，SMARCE1）、DnaJhomolog subfamily B member 14（DnaJ同源亞家族B成員14，DNAJB14）、NEDD4-binding protein 1（NEDD4結(jié)合蛋白1，N4BP1）、Trans-acting T-cellspecific transcription factor GATA-3（反式作用T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3，GATA-3）、Rho GTPase-activating protein 39（Rho GTP酶激活蛋白39，RHOGAP39）、Tubulinyl-Tyr carboxypeptidase 1（微管蛋白酪氨酸羧肽酶1，TTC1）、Anaphase-promoting complex subunit 4（后期促進(jìn)復(fù)合亞基4，ANAPC4）、Anaphase-promoting complex subunit 5（后期促進(jìn)復(fù)合亞基5，ANAPC5）、cAMP-regulated phosphoprotein 19（cAMP調(diào)節(jié)磷蛋白19，ARPP19）、Zinc finger protein 266（鋅指蛋白266，ZFP266）。前10種顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)是Perilipin-1（外周脂蛋白-1，PLIN1）、Diacylglycerol kinase zeta（甘油二酯激酶ζ，DGKζ）、Cathelicidin antimicrobial peptide（組織蛋白酶抑制素抗菌肽，CAMP）、Fatty acid-binding protein，adipocyte（脂肪酸結(jié)合蛋白，脂肪細(xì)胞，F(xiàn)ABP）、Iron-responsive element-binding protein 2（鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2，IRP2或IREB2）、Melanocyte protein PMEL（黑素細(xì)胞蛋白，PMEL）、Protein S100-A9（蛋白質(zhì)S100-A9，S100-A9）、Zinc finger protein 397（鋅指蛋白397，ZFP397）、Ankyrin repeat domain-containing protein 22（含有連結(jié)蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)22，ANKRD22）、Protein S100-A8（蛋白S100-A8，S100-A8）。蛋白定量結(jié)果以火山圖形式展示（圖1）。

圖1 兩組輸尿管組織標(biāo)本之間的差異火山圖 以A、B組樣本間蛋白質(zhì)表達(dá)的差異倍數(shù)以及t檢驗(yàn)得到的P值繪制火山圖，用于呈現(xiàn)兩組樣本數(shù)據(jù)的差異。以差異倍數(shù)（以2為底的對(duì)數(shù)變換）作為橫坐標(biāo)，差異的P值（以10為底的對(duì)數(shù)變換）作為縱坐標(biāo)，圖中黑點(diǎn)為差異表達(dá)不顯著的蛋白，紅點(diǎn)為差異表達(dá)顯著的蛋白（倍數(shù)變化大于1.2倍且P＜0.05）Fig.1 Volcano plot of differences between group A and group B

三、差異表達(dá)蛋白聚類分析

采用層次聚類算法對(duì)A、B兩組差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行聚類分析，并采用熱圖形式進(jìn)行數(shù)據(jù)呈現(xiàn)（圖2），以倍數(shù)變化大于1.2且P值小于0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選獲取的差異表達(dá)蛋白質(zhì)能夠有效地把比較組分開，進(jìn)一步表明差異表達(dá)蛋白篩選的合理性。

圖2 兩組輸尿管組織標(biāo)本差異表達(dá)蛋白質(zhì)的聚類分析結(jié)果 層次聚類結(jié)果采用樹型熱圖呈現(xiàn)，圖中每一列代表一份樣品（橫坐標(biāo)為樣品信息），每一行代表一種蛋白（縱坐標(biāo)為表達(dá)具有顯著性差異的蛋白），A、B兩組各有3份樣品。在熱圖中，以不同顏色展現(xiàn)顯著性差異表達(dá)蛋白在各樣品中表達(dá)量的對(duì)數(shù)值，紅色為顯著性上調(diào)，藍(lán)色為顯著性下調(diào)，無(wú)蛋白定量信息用灰色表示Fig.2 Clustering for differentially expressed proteins between group A and group B

四、差異表達(dá)蛋白質(zhì)GO功能富集分析

對(duì)兩組差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果表明，體液免疫反應(yīng)、抗微生物體液反應(yīng)、對(duì)真菌的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌的防御反應(yīng)等生物過程，碳酸鹽脫水酶活性、MHCⅡ類受體活性、Toll樣受體結(jié)合等分子功能以及二聚體IgA免疫球蛋白復(fù)合物、特異顆粒腔、免疫球蛋白復(fù)合物等定位蛋白變化顯著（圖3）。

圖3 兩組輸尿管組織標(biāo)本差異表達(dá)蛋白的GO功能富集分析 圖中橫坐標(biāo)為富集到的GO功能分類，包括生物過程、分子功能和細(xì)胞組分3類；縱坐標(biāo)為各功能分類下差異蛋白質(zhì)的數(shù)目；條形圖由橘色至紅色漸變，越接近紅色表明P值越小；條形圖上方標(biāo)簽為富集因子，代表某GO功能類別鑒定到的所有蛋白中，注釋到該GO功能類別的差異表達(dá)蛋白數(shù)目所占的比例Fig.3 Enrichment analysis for GO function of differentially expressed proteins between group A and group B

五、差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG通路富集分析

對(duì)A、B兩組的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果表明，氮代謝、PPAR信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、炎癥性腸病、人T細(xì)胞白血病病毒1感染、脂肪細(xì)胞脂解調(diào)節(jié)、胰島素抵抗、Th17細(xì)胞分化、膽汁分泌、Th1和Th2細(xì)胞分化、AMPK信號(hào)通路、金黃色葡萄球菌感染、結(jié)核病、膽固醇代謝、甘油脂代謝等重要通路變化顯著（圖4）。

圖4 兩組輸尿管組織標(biāo)本差異表達(dá)蛋白KEGG通路富集分析Fig.4 Enrichment analysis for KEGG pathway of differentially expressed proteins between group A and group B

六、PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將兩組的差異表達(dá)蛋白構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，處于關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)、連接度最高的兩種蛋白質(zhì)是中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和組織蛋白酶抑制素抗菌肽（cathelicidin antimicrobial peptide，CAMP）。

圖5 兩組輸尿管組織標(biāo)本差異表達(dá)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 圖中的黃色結(jié)點(diǎn)代表蛋白，線代表蛋白-蛋白之間的相互作用。與某種蛋白直接相互作用的蛋白數(shù)目表示該蛋白的連接度Fig.5 PPI of differentially expressed proteins between group A and group B

七、PRM相對(duì)定量分析

本次實(shí)驗(yàn)所選取的9種目標(biāo)蛋白在A組與B組間的表達(dá)量存在一定的差異（表1）。PRM的定量結(jié)果和TMT總體趨勢(shì)非常一致（表2）。

表1 目標(biāo)蛋白PRM相對(duì)定量分析結(jié)果Table 1 Relative quantitative analysis results of PRM of target proteins

表2 PRM和TMT的定量結(jié)果比較Table 2 Comparison of quantitative results of PRM and TMT

討 論

蛋白質(zhì)組學(xué)研究可用于多種疾病標(biāo)志物的篩選，也可解釋細(xì)胞在不同因素下的病理生理機(jī)制［4-5］。本研究利用TMT蛋白定量結(jié)合PRM靶向

蛋白驗(yàn)證技術(shù)，對(duì)先天性UPJ狹窄患兒狹窄段輸尿管組織與鄰近的正常輸尿管組織進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析。TMT技術(shù)利用同位素試劑標(biāo)記，通過高分辨質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時(shí)對(duì)十多種樣品之間的蛋白表達(dá)量進(jìn)行比較［6］。利用該技術(shù)，我們篩選出了160種差異蛋白。從差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中隨機(jī)選取20種蛋白質(zhì)進(jìn)行PRM靶向蛋白驗(yàn)證，成功定量到9種差異蛋白，且PRM的定量結(jié)果和TMT總體趨勢(shì)非常一致，說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)體系的穩(wěn)定性和定量的準(zhǔn)確性。

狹窄段輸尿管組織表達(dá)上調(diào)的前10位蛋白質(zhì)，其功能主要涉及基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)降解、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元發(fā)育、細(xì)胞周期、胚胎發(fā)育等生物學(xué)過程［7-10］。狹窄段輸尿管組織表達(dá)下調(diào)的前10位蛋白質(zhì)，其功能主要涉及脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、針對(duì)感染和腫瘤的免疫應(yīng)答、抗微生物活性、神經(jīng)變性等生物學(xué)過程［11-23］。

GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要涉及體液免疫反應(yīng)、抗微生物體液反應(yīng)、對(duì)真菌的反應(yīng)、對(duì)真菌的防御反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌的防御反應(yīng)等與微生物感染相關(guān)的生物過程。

在PPI網(wǎng)絡(luò)中，處于關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)、連接度最高的兩種蛋白是NE和CAMP，它們均與微生物感染以及感染相關(guān)的炎癥反應(yīng)聯(lián)系密切。CAMP是一種重要的先天免疫效應(yīng)分子，由循環(huán)免疫細(xì)胞、骨髓祖細(xì)胞和免疫屏障部位的上皮表面（如呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道上皮）產(chǎn)生［24］。作為一種內(nèi)源性抗菌肽，CAMP具有廣譜強(qiáng)抗菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性高于常規(guī)的抗生素，對(duì)結(jié)核分枝桿菌也有較強(qiáng)的抗菌活性［25-28］。NE是一種具有廣泛底物特異性的顆粒狀絲氨酸蛋白酶，在人中性粒細(xì)胞中表達(dá)和儲(chǔ)存，在中性粒細(xì)胞激活時(shí)釋放，主要參與宿主防御。中性粒細(xì)胞是先天免疫的先行者，保護(hù)宿主免受感染性病原體的侵害。在這個(gè)過程中，中性粒細(xì)胞到達(dá)炎癥/感染部位，通過吞噬作用以及形成由NE、明膠酶、髓過氧化物酶等顆粒蛋白組成的中性粒細(xì)胞胞外陷阱來(lái)清除病原體（包括細(xì)菌、真菌、病毒）［29］。在吞噬病原體衍生化合物等外來(lái)物質(zhì)的過程中，NE和其他蛋白也會(huì)被排泄到周圍的細(xì)胞外環(huán)境中，攻擊入侵微生物的蛋白，同時(shí)使宿主細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白（如Ⅳ型膠原和彈性蛋白）水解［30］。金黃色葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌和肺炎支原體感染者的NE分泌均增加［31-33］。由于NE具有降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的潛力，在抵抗微生物感染的同時(shí)，可能參與局部組織損傷，導(dǎo)致UPJ狹窄。當(dāng)然，這種假說(shuō)還需要更多的后續(xù)研究去驗(yàn)證。

綜上所述，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)先天性UPJ狹窄患兒狹窄段輸尿管組織與鄰近正常輸尿管組織的差異蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要涉及微生物感染、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、脂質(zhì)代謝等生物學(xué)過程。微生物感染后往往繼發(fā)炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)，而脂質(zhì)代謝與炎癥反應(yīng)之間也存在密切關(guān)聯(lián)。但生物信息學(xué)方法也存在一定的局限性，通過生物信息學(xué)方法富集獲得的多條信號(hào)通路，需要進(jìn)行大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這些驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在后續(xù)的研究中是必不可少的。根據(jù)本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，雖然尚不能肯定微生物感染是先天性UPJ狹窄的病因，但高度提示先天性UPJ狹窄的發(fā)生與微生物感染相關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明文獻(xiàn)檢索為紀(jì)延輝、覃宇冰，論文調(diào)查設(shè)計(jì)為黃文倩、何朝升，數(shù)據(jù)收集與分析為黃桂珍、楊國(guó)柱、胡增隆，論文結(jié)果撰寫為劉靖，論文討論分析為劉明學(xué)、楊振宇、蘇毅