黎小蘭，蔡良平，付小蓉，潘拾朝，陳彩云，吳斯燕

（湯臣倍健股份有限公司，廣東珠海 519040）

隨著社會的發(fā)展和生活節(jié)奏的加快，人們的飲食習(xí)慣和結(jié)構(gòu)都有所改變，各類的慢性病患數(shù)量也隨之上升，一些患者在生理機能上的需求跟普通人存在一定的差異，老年人機體代謝能力的衰退引起了食欲下降、胃腸道功能下降[1]，年輕的白領(lǐng)久坐和加班加點工作缺乏運動也有引起慢性病的危險。換言之，普通的食品已經(jīng)滿足不了他們的需求，所以特殊醫(yī)學(xué)配方食品便迎合了他們的需求。特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品是為了滿足進(jìn)食受限、消化吸收障礙、代謝后特定疾病人群對營養(yǎng)素的特殊需要，經(jīng)專門加工研制而成的。其可以為正在治療、康復(fù)及機體功能維持過程中的患者提供營養(yǎng)支持，糾正代謝失衡，增強治療效果，促進(jìn)康復(fù)[2-4]。特殊醫(yī)學(xué)配方食品在使用時需要遵守醫(yī)生或營養(yǎng)師的建議和指導(dǎo)，以特定的疾病患者為使用人群，因而其在產(chǎn)品管理和配方上有一定的特殊性。該類產(chǎn)品建立在醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)的基礎(chǔ)之上，需要科學(xué)的依據(jù)來證明其安全性和有效性[5-6]。

而在特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中添加維生素等是常見的加工配制手段。水溶性維生素，如B 族維生素中的泛酸、維B1、維B2、維B6、煙酰胺，以及近年熱門的左旋肉堿，都是特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品里添加的營養(yǎng)素。

泛酸又稱維B5、遍多酸，是一種水溶性維生素，幾乎存在于所有活細(xì)胞中[7]，參與人體中類固醇、褪黑激素、抗體和亞鐵血紅素合成的重要物質(zhì)[8]，泛酸可以加強皮膚的新陳代謝，對皮膚有水合功能，繼而能改善皮膚的干燥、脫屑、粗糙、止癢等癥狀[9-10]。

煙酰胺與蛋白質(zhì)的代謝及兒童智力發(fā)育關(guān)系密切[11]，并在維持皮膚和消化器官正常功能中起重要作用。

左旋肉堿又稱肉毒堿或維生素BT，是人類必需的一種營養(yǎng)素，其主要功能是轉(zhuǎn)運脂肪進(jìn)入線粒體，促進(jìn)脂肪酸氧化，為機體提供能量[12-13]。

而隨著新原料、新技術(shù)及市場需求的變化，以某一類成分總量作為標(biāo)志性功能成分的評判方法難以評估產(chǎn)品質(zhì)量，因此，對特定功能成分進(jìn)行有效測定，對特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的質(zhì)量控制具有重要的意義。目前，檢測泛酸、煙酰胺和左旋肉堿的方法有薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、紫外分光光度法、液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜法等[14]。主要通過方法學(xué)驗證以建立一種高效、準(zhǔn)確、適用實際工作、能同時有效檢測這3 種成分的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1260 型高效液相色譜儀、API3200 型質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent Eclipse XDB-phenyl 色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），美國安捷倫公司產(chǎn)品；EQ-500型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C 型pH 計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品。

甲醇（色譜純）、一級用水、甲酸（色譜純），德國CNW 科技公司提供；鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純），廣州化學(xué)試劑廠提供；煙酰胺（對照品來源：SUPELCO，批號：LC22915V，純度：99.9%）；泛酸鈣（對照品來源：中國食品藥品檢定研究院，批號：100370-201402，純度：97.5%）；左旋肉堿（對照品來源：Dr，批號：G139676，純度：95.5%）。

特殊醫(yī)學(xué)配方粉（主要成分為蛋白質(zhì)、低聚果糖、多種維生素、DHA、EPA 等），湯臣倍健股份有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 液相色譜法儀器條件

液相條件：色譜柱Phenomenex，Kinetex，XBC18，100 mm×4.6 mm，3.5 μm；柱溫40 ℃；流動相A：0.1%甲酸溶液，流動相B：甲醇；梯度洗脫程序，進(jìn)樣量為5.0 或2.0 μL。

流動相條件見表1。

表1 流動相條件

質(zhì)譜條件：離子模式為ESI+模式；運行時間為13 min。

1.2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取泛酸鈣對照品24.69 mg，左旋肉堿對照品24.94 mg 于25 mL 棕色容量瓶中，煙酰胺對照品10.20 mg 于50 mL 容量瓶中，用0.1%甲酸水溶解、定容，制成泛酸鈣質(zhì)量濃度為0.962 9 mg/mL對照品溶液，左旋肉堿質(zhì)量濃度為0.952 7 mg/mL 對照品溶液，煙酰胺質(zhì)量濃度為0.203 8 mg/mL 對照品溶液，作為儲備液；再分別稀釋為泛酸鈣質(zhì)量濃度為0.962 9 μg/mL，左旋肉堿質(zhì)量濃度為0.952 7 μg/mL對照品溶液，煙酰胺質(zhì)量濃度為0.203 8 μg/mL 對照品溶液，作為對照品使用液，搖勻，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后待進(jìn)樣。

1.2.3 供試品溶液制備

取特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品粉末約5 g，精密稱定，置燒杯中，加入濃度為0.1 mol/L 的鹽酸溶液約適量，室溫超聲處理30 min，放冷，用濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至4.0~4.5，轉(zhuǎn)移并用水定容至50 mL 容量瓶中，搖勻后取50 mL 溶液至離心管中，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心5 min，取上清液，用水稀釋10 倍，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后，即得供試品溶液。

1.2.4 測定

精密吸取對照品溶液進(jìn)樣量1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μL 與供試品溶液進(jìn)樣量5.0 μL 或2.0 μL，注入高效液相色譜儀，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。在1.2.1分析方法的條件下，進(jìn)行分析測定。

質(zhì)譜條件見表2。

表2 質(zhì)譜條件

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試樣中泛酸的含量按如下公式計算：

試樣中煙酰胺/ 左旋肉堿的含量按如下公式計算：

式中：X——試樣中泛酸的含量，%；

V——試樣稀釋的體積，mL；

C——試樣溶液中泛酸鈣/煙酰胺/左旋肉堿的濃度，mg/mL；

m——試樣的質(zhì)量，g；

k——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)，k=0.1；

0.92——泛酸鈣換成泛酸的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法空白試驗

稱取空白樣品，按1.2.4 試樣制備方法處理空白溶液，按1.2.1 色譜條件測定空白溶液，與泛酸鈣、左旋肉堿和煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時間對比。

特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖（左圖） 與泛酸色譜圖（右圖） 見圖1，特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖（左圖） 與煙酰胺色譜圖（右圖） 見圖2，特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖（左圖） 與左旋肉堿色譜圖（右圖） 見圖3。

圖1 特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖（左圖） 與泛酸色譜圖（右圖)

圖2 特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖（左圖） 與煙酰胺色譜圖（右圖)

圖3 特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖（左圖） 與左旋肉堿色譜圖（右圖)

空白溶液在對照品溶液的各成分出峰時間處均無吸收峰，表明空白對測定結(jié)果無干擾。

2.2 線性范圍確認(rèn)

2.2.1 試驗數(shù)據(jù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 線性試驗結(jié)論

線性評價：相關(guān)性分別為0.999 9，0.999 5，0.999 9，所以用該方法測定泛酸、煙酰胺、左旋肉堿在質(zhì)量濃度為0.2~2.2 μg/mL 呈現(xiàn)良好的線性。

2.3 檢出限和定量限

分析方法的檢出限D(zhuǎn)L 和定量限QL 由信噪比（S/N） 計算。DL 定義為S/N=3 時對應(yīng)的待分析濃度，QL 定義為S/N=10 時對應(yīng)的待分析濃度。

2.3.1 檢出限

當(dāng)信噪比（S/N） 為3 時，泛酸檢出限為0.001 94 μg/mL；當(dāng)稱取量為5.0 g，定容至50 mL 時，該方法的泛酸檢出限為0.019 4 μg/g；煙酰胺檢出限為0.005 43 μg/mL；當(dāng)稱取量為5.0 g，定容至50 mL時，該方法的煙酰胺檢出限為0.054 3 μg/g；左旋肉堿檢出限為0.003 97 μg/mL；當(dāng)稱取量為5.0 g，定容至50 mL 時，該方法測定的左旋肉堿檢出限為0.039 7 μg/g。

2.3.2 定量限

當(dāng)信噪比（S/N） 為10 時，該方法的泛酸定量限為0.006 4 μg/mL；當(dāng)稱取量為5.0 g，定容至50 mL時，該方法的泛酸定量限為0.064 μg/g；煙酰胺定量限為0.018 1 μg/mL；當(dāng)稱取量為5.0 g，定容至50 mL 時，該方法的泛酸定量限為0.181 μg/g；左旋肉堿定量限為0.013 2 μg/mL；當(dāng)稱取量為5.0 g，定容至50 mL 時，該方法的泛酸定量限為0.132 μg/g。

2.4 精密度試驗

2.4.1 試驗方法

稱取6 份樣品，按1.2.3 試樣制備方法處理樣品，按1.2.1 色譜條件測定檢測樣品含量，計算其RSD（%）。

2.4.2 試驗數(shù)據(jù)

精密度結(jié)果見表4。

表4 精密度結(jié)果

2.4.3 試驗結(jié)論

6 份樣品泛酸含量的RSD 為2.8%，煙酰胺含量的RSD 為0.7%，左旋肉堿含量的RSD 為0.7%，表明該方法有較好的精密度。

2.5 穩(wěn)定性試驗

2.5.1 試驗方法

將樣品溶液分別在室溫下放置0，30，60，120，240，640 min 后，按2.2.1 條件測定峰面積，計算其RSD（%）。

2.5.2 試驗數(shù)據(jù)

耐用性試驗結(jié)果見表5。

表5 耐用性試驗結(jié)果

2.5.3 試驗結(jié)論

樣品溶液分別在室溫下放置0，30，60，120，240，640 min 后，RSD（%） 分別為1.8%，1.8%，1.1%，表明樣品溶液在室溫下8 h 內(nèi)泛酸、煙酰胺和左旋肉堿的穩(wěn)定性良好。

2.6 回收率試驗

2.6.1 試驗方法

加標(biāo)：精密稱取約5.0 g 樣品9 份（已知樣品的泛酸含量1.92 mg/100 g；煙酰胺含量為4.39 mg/100 g；左旋肉堿含量為17.20 mg/100 g），分成3 組，每組3 份，各組分別精密加入泛酸加標(biāo)液（質(zhì)量濃度0.096 31 mg/mL） 1.5，2.0，2.5 mL，煙酰胺加標(biāo)液（質(zhì)量濃度為0.225 1 mg/mL） 2.0，2.5，3.0 mL，左旋肉堿加標(biāo)液（質(zhì)量濃度為0.263 8 mg/mL） 0.6，0.8，1.0 mL。按2.2.3 試樣制備方法處理樣品。

2.6.2 試驗方法

回收率結(jié)果見表6。

表6 回收率結(jié)果

2.6.3 試驗結(jié)論

平均回收率分別為96.48%，97.03%，95.11%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 分別為5.3%，8.2%，6.2%。

4 結(jié)論

建立了一種酸堿沉淀法沉淀蛋白質(zhì)后，經(jīng)液相-串聯(lián)質(zhì)譜檢測特殊醫(yī)學(xué)配方食品中泛酸、煙酰胺和左旋肉堿含量的方法。結(jié)果表明，通過選用優(yōu)化后的質(zhì)譜條件下，在MRM 掃描模式下，樣品中的泛酸、煙酰胺和左旋肉堿能在13 min 內(nèi)實現(xiàn)快速分離檢測，并無雜質(zhì)干擾，可實現(xiàn)對目標(biāo)物的針對性檢測，并通過對該方法的檢出限、空白試驗、穩(wěn)定性試驗、線性確認(rèn)、回收率試驗等確認(rèn)，證明該方法能同時準(zhǔn)確快速地檢測特殊醫(yī)學(xué)配方食品中的泛酸、煙酰胺和左旋肉堿含量，具有快速、簡單、準(zhǔn)確、靈敏等特點，有助于實驗室的分析效率，確保產(chǎn)品質(zhì)量, 降低成本，為特殊醫(yī)學(xué)配方食品中泛酸、煙酰胺和左旋肉堿含量的測定提供參考。