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        液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測定特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中泛酸煙酰胺和左旋肉堿的含量

        2022-05-26 07:08:00黎小蘭蔡良平付小蓉潘拾朝陳彩云吳斯燕
        農(nóng)產(chǎn)品加工 2022年8期
        關(guān)鍵詞:泛酸煙酰胺肉堿

        黎小蘭,蔡良平,付小蓉,潘拾朝,陳彩云,吳斯燕

        (湯臣倍健股份有限公司,廣東珠海 519040)

        隨著社會(huì)的發(fā)展和生活節(jié)奏的加快,人們的飲食習(xí)慣和結(jié)構(gòu)都有所改變,各類的慢性病患數(shù)量也隨之上升,一些患者在生理機(jī)能上的需求跟普通人存在一定的差異,老年人機(jī)體代謝能力的衰退引起了食欲下降、胃腸道功能下降[1],年輕的白領(lǐng)久坐和加班加點(diǎn)工作缺乏運(yùn)動(dòng)也有引起慢性病的危險(xiǎn)。換言之,普通的食品已經(jīng)滿足不了他們的需求,所以特殊醫(yī)學(xué)配方食品便迎合了他們的需求。特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品是為了滿足進(jìn)食受限、消化吸收障礙、代謝后特定疾病人群對營養(yǎng)素的特殊需要,經(jīng)專門加工研制而成的。其可以為正在治療、康復(fù)及機(jī)體功能維持過程中的患者提供營養(yǎng)支持,糾正代謝失衡,增強(qiáng)治療效果,促進(jìn)康復(fù)[2-4]。特殊醫(yī)學(xué)配方食品在使用時(shí)需要遵守醫(yī)生或營養(yǎng)師的建議和指導(dǎo),以特定的疾病患者為使用人群,因而其在產(chǎn)品管理和配方上有一定的特殊性。該類產(chǎn)品建立在醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)的基礎(chǔ)之上,需要科學(xué)的依據(jù)來證明其安全性和有效性[5-6]。

        而在特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中添加維生素等是常見的加工配制手段。水溶性維生素,如B 族維生素中的泛酸、維B1、維B2、維B6、煙酰胺,以及近年熱門的左旋肉堿,都是特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品里添加的營養(yǎng)素。

        泛酸又稱維B5、遍多酸,是一種水溶性維生素,幾乎存在于所有活細(xì)胞中[7],參與人體中類固醇、褪黑激素、抗體和亞鐵血紅素合成的重要物質(zhì)[8],泛酸可以加強(qiáng)皮膚的新陳代謝,對皮膚有水合功能,繼而能改善皮膚的干燥、脫屑、粗糙、止癢等癥狀[9-10]。

        煙酰胺與蛋白質(zhì)的代謝及兒童智力發(fā)育關(guān)系密切[11],并在維持皮膚和消化器官正常功能中起重要作用。

        左旋肉堿又稱肉毒堿或維生素BT,是人類必需的一種營養(yǎng)素,其主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪進(jìn)入線粒體,促進(jìn)脂肪酸氧化,為機(jī)體提供能量[12-13]。

        而隨著新原料、新技術(shù)及市場需求的變化,以某一類成分總量作為標(biāo)志性功能成分的評判方法難以評估產(chǎn)品質(zhì)量,因此,對特定功能成分進(jìn)行有效測定,對特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的質(zhì)量控制具有重要的意義。目前,檢測泛酸、煙酰胺和左旋肉堿的方法有薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、紫外分光光度法、液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜法等[14]。主要通過方法學(xué)驗(yàn)證以建立一種高效、準(zhǔn)確、適用實(shí)際工作、能同時(shí)有效檢測這3 種成分的方法。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        1260 型高效液相色譜儀、API3200 型質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent Eclipse XDB-phenyl 色譜柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm),美國安捷倫公司產(chǎn)品;EQ-500型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品;PHS-3C 型pH 計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品。

        甲醇(色譜純)、一級用水、甲酸(色譜純),德國CNW 科技公司提供;鹽酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純),廣州化學(xué)試劑廠提供;煙酰胺(對照品來源:SUPELCO,批號(hào):LC22915V,純度:99.9%);泛酸鈣(對照品來源:中國食品藥品檢定研究院,批號(hào):100370-201402,純度:97.5%);左旋肉堿(對照品來源:Dr,批號(hào):G139676,純度:95.5%)。

        特殊醫(yī)學(xué)配方粉(主要成分為蛋白質(zhì)、低聚果糖、多種維生素、DHA、EPA 等),湯臣倍健股份有限公司提供。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 液相色譜法儀器條件

        液相條件:色譜柱Phenomenex,Kinetex,XBC18,100 mm×4.6 mm,3.5 μm;柱溫40 ℃;流動(dòng)相A:0.1%甲酸溶液,流動(dòng)相B:甲醇;梯度洗脫程序,進(jìn)樣量為5.0 或2.0 μL。

        流動(dòng)相條件見表1。

        表1 流動(dòng)相條件

        質(zhì)譜條件:離子模式為ESI+模式;運(yùn)行時(shí)間為13 min。

        1.2.2 對照品溶液制備

        分別精密稱取泛酸鈣對照品24.69 mg,左旋肉堿對照品24.94 mg 于25 mL 棕色容量瓶中,煙酰胺對照品10.20 mg 于50 mL 容量瓶中,用0.1%甲酸水溶解、定容,制成泛酸鈣質(zhì)量濃度為0.962 9 mg/mL對照品溶液,左旋肉堿質(zhì)量濃度為0.952 7 mg/mL 對照品溶液,煙酰胺質(zhì)量濃度為0.203 8 mg/mL 對照品溶液,作為儲(chǔ)備液;再分別稀釋為泛酸鈣質(zhì)量濃度為0.962 9 μg/mL,左旋肉堿質(zhì)量濃度為0.952 7 μg/mL對照品溶液,煙酰胺質(zhì)量濃度為0.203 8 μg/mL 對照品溶液,作為對照品使用液,搖勻,經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后待進(jìn)樣。

        1.2.3 供試品溶液制備

        取特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品粉末約5 g,精密稱定,置燒杯中,加入濃度為0.1 mol/L 的鹽酸溶液約適量,室溫超聲處理30 min,放冷,用濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至4.0~4.5,轉(zhuǎn)移并用水定容至50 mL 容量瓶中,搖勻后取50 mL 溶液至離心管中,以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心5 min,取上清液,用水稀釋10 倍,經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后,即得供試品溶液。

        1.2.4 測定

        精密吸取對照品溶液進(jìn)樣量1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 μL 與供試品溶液進(jìn)樣量5.0 μL 或2.0 μL,注入高效液相色譜儀,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。在1.2.1分析方法的條件下,進(jìn)行分析測定。

        質(zhì)譜條件見表2。

        表2 質(zhì)譜條件

        1.2.5 數(shù)據(jù)處理

        試樣中泛酸的含量按如下公式計(jì)算:

        試樣中煙酰胺/ 左旋肉堿的含量按如下公式計(jì)算:

        式中:X——試樣中泛酸的含量,%;

        V——試樣稀釋的體積,mL;

        C——試樣溶液中泛酸鈣/煙酰胺/左旋肉堿的濃度,mg/mL;

        m——試樣的質(zhì)量,g;

        k——單位轉(zhuǎn)換系數(shù),k=0.1;

        0.92——泛酸鈣換成泛酸的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 方法空白試驗(yàn)

        稱取空白樣品,按1.2.4 試樣制備方法處理空白溶液,按1.2.1 色譜條件測定空白溶液,與泛酸鈣、左旋肉堿和煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時(shí)間對比。

        特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖(左圖) 與泛酸色譜圖(右圖) 見圖1,特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖(左圖) 與煙酰胺色譜圖(右圖) 見圖2,特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖(左圖) 與左旋肉堿色譜圖(右圖) 見圖3。

        圖1 特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖(左圖) 與泛酸色譜圖(右圖)

        圖2 特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖(左圖) 與煙酰胺色譜圖(右圖)

        圖3 特殊醫(yī)學(xué)配方粉中空白色譜圖(左圖) 與左旋肉堿色譜圖(右圖)

        空白溶液在對照品溶液的各成分出峰時(shí)間處均無吸收峰,表明空白對測定結(jié)果無干擾。

        2.2 線性范圍確認(rèn)

        2.2.1 試驗(yàn)數(shù)據(jù)

        標(biāo)準(zhǔn)曲線見表3。

        表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.2.2 線性試驗(yàn)結(jié)論

        線性評價(jià):相關(guān)性分別為0.999 9,0.999 5,0.999 9,所以用該方法測定泛酸、煙酰胺、左旋肉堿在質(zhì)量濃度為0.2~2.2 μg/mL 呈現(xiàn)良好的線性。

        2.3 檢出限和定量限

        分析方法的檢出限D(zhuǎn)L 和定量限QL 由信噪比(S/N) 計(jì)算。DL 定義為S/N=3 時(shí)對應(yīng)的待分析濃度,QL 定義為S/N=10 時(shí)對應(yīng)的待分析濃度。

        2.3.1 檢出限

        當(dāng)信噪比(S/N) 為3 時(shí),泛酸檢出限為0.001 94 μg/mL;當(dāng)稱取量為5.0 g,定容至50 mL 時(shí),該方法的泛酸檢出限為0.019 4 μg/g;煙酰胺檢出限為0.005 43 μg/mL;當(dāng)稱取量為5.0 g,定容至50 mL時(shí),該方法的煙酰胺檢出限為0.054 3 μg/g;左旋肉堿檢出限為0.003 97 μg/mL;當(dāng)稱取量為5.0 g,定容至50 mL 時(shí),該方法測定的左旋肉堿檢出限為0.039 7 μg/g。

        2.3.2 定量限

        當(dāng)信噪比(S/N) 為10 時(shí),該方法的泛酸定量限為0.006 4 μg/mL;當(dāng)稱取量為5.0 g,定容至50 mL時(shí),該方法的泛酸定量限為0.064 μg/g;煙酰胺定量限為0.018 1 μg/mL;當(dāng)稱取量為5.0 g,定容至50 mL 時(shí),該方法的泛酸定量限為0.181 μg/g;左旋肉堿定量限為0.013 2 μg/mL;當(dāng)稱取量為5.0 g,定容至50 mL 時(shí),該方法的泛酸定量限為0.132 μg/g。

        2.4 精密度試驗(yàn)

        2.4.1 試驗(yàn)方法

        稱取6 份樣品,按1.2.3 試樣制備方法處理樣品,按1.2.1 色譜條件測定檢測樣品含量,計(jì)算其RSD(%)。

        2.4.2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)

        精密度結(jié)果見表4。

        表4 精密度結(jié)果

        2.4.3 試驗(yàn)結(jié)論

        6 份樣品泛酸含量的RSD 為2.8%,煙酰胺含量的RSD 為0.7%,左旋肉堿含量的RSD 為0.7%,表明該方法有較好的精密度。

        2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        2.5.1 試驗(yàn)方法

        將樣品溶液分別在室溫下放置0,30,60,120,240,640 min 后,按2.2.1 條件測定峰面積,計(jì)算其RSD(%)。

        2.5.2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)

        耐用性試驗(yàn)結(jié)果見表5。

        表5 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

        2.5.3 試驗(yàn)結(jié)論

        樣品溶液分別在室溫下放置0,30,60,120,240,640 min 后,RSD(%) 分別為1.8%,1.8%,1.1%,表明樣品溶液在室溫下8 h 內(nèi)泛酸、煙酰胺和左旋肉堿的穩(wěn)定性良好。

        2.6 回收率試驗(yàn)

        2.6.1 試驗(yàn)方法

        加標(biāo):精密稱取約5.0 g 樣品9 份(已知樣品的泛酸含量1.92 mg/100 g;煙酰胺含量為4.39 mg/100 g;左旋肉堿含量為17.20 mg/100 g),分成3 組,每組3 份,各組分別精密加入泛酸加標(biāo)液(質(zhì)量濃度0.096 31 mg/mL) 1.5,2.0,2.5 mL,煙酰胺加標(biāo)液(質(zhì)量濃度為0.225 1 mg/mL) 2.0,2.5,3.0 mL,左旋肉堿加標(biāo)液(質(zhì)量濃度為0.263 8 mg/mL) 0.6,0.8,1.0 mL。按2.2.3 試樣制備方法處理樣品。

        2.6.2 試驗(yàn)方法

        回收率結(jié)果見表6。

        表6 回收率結(jié)果

        2.6.3 試驗(yàn)結(jié)論

        平均回收率分別為96.48%,97.03%,95.11%;相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 分別為5.3%,8.2%,6.2%。

        4 結(jié)論

        建立了一種酸堿沉淀法沉淀蛋白質(zhì)后,經(jīng)液相-串聯(lián)質(zhì)譜檢測特殊醫(yī)學(xué)配方食品中泛酸、煙酰胺和左旋肉堿含量的方法。結(jié)果表明,通過選用優(yōu)化后的質(zhì)譜條件下,在MRM 掃描模式下,樣品中的泛酸、煙酰胺和左旋肉堿能在13 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速分離檢測,并無雜質(zhì)干擾,可實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的針對性檢測,并通過對該方法的檢出限、空白試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、線性確認(rèn)、回收率試驗(yàn)等確認(rèn),證明該方法能同時(shí)準(zhǔn)確快速地檢測特殊醫(yī)學(xué)配方食品中的泛酸、煙酰胺和左旋肉堿含量,具有快速、簡單、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn),有助于實(shí)驗(yàn)室的分析效率,確保產(chǎn)品質(zhì)量, 降低成本,為特殊醫(yī)學(xué)配方食品中泛酸、煙酰胺和左旋肉堿含量的測定提供參考。

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