牛 越,王新茹,姚秀君,王君楚,包鴻慧
(1. 湖北文理學院 食品科學技術學院,湖北 襄陽 441000;2. 湖北保儂康血耳科技開發(fā)有限公司,湖北 襄陽 441600)
免疫是人體重要的防御屏障,無論是對癌癥的預防,還是對新冠肺炎病毒的對抗,增強機體免疫力尤為關鍵[1]。血耳又名血銀耳,是一種傳統(tǒng)名貴藥食兼用珍稀食用菌,具有益氣活血,平肝陽、去熱毒的功效,常用于婦科疾病、痢疾和急性肝炎等的治療[2-3]。多糖是食用菌中的主要活性成分,目前對血耳多糖的研究報道不多[4],而對血耳免疫活性未見報道。采用熱水浸提法從血耳子實體中提取血耳多糖,研究其對小鼠巨噬細胞的免疫活性,為血耳資源的研究與開發(fā)提供試驗科學依據。
血耳,湖北保儂康血耳科技開發(fā)有限公司提供,原料去雜,鼓風干燥,打磨,過60 目篩,-20 ℃下保存;RPMI-1640 培養(yǎng)基(含胎牛血清),瑞士Roche 公司提供;水溶性四唑鹽(WST-1),美國標準生物品收藏中心(ATCC),小鼠巨噬細胞;其余試劑均為國產分析純級。
離子交換色譜,加拿大戴安公司產品;R200 型旋轉蒸發(fā)器,瑞士BUCHI 公司產品;HC-3514 型離心機,科大創(chuàng)新股份有限公司產品;EL-800 型酶聯(lián)檢測儀,美國BioTek 公司產品。
1.3.1 血耳子實體多糖的提取
血耳粉末按料液比1∶10 沸水浸提2 h,冷卻,以轉速4 000 r/min 離心15 min。取上清液,旋轉蒸發(fā)儀濃縮,濃縮液按1∶4 乙醇沉淀,冰箱中4 ℃下過夜,離心取沉淀,經復溶、透析、凍干,得血耳多糖。
1.3.2 血耳子實體多糖化學組成分析
含糖量測定采用硫酸苯酚法,蛋白含量測定選用lowry 法,單糖含量測定采用離子交換色譜法[5]。
1.3.3 血耳多糖對癌細胞的抑制作用
取含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基,于96 孔培養(yǎng)板上接種人胃腺癌細胞(AGS)、結腸腺癌細胞(DLD-1) 和子宮頸癌細胞(HLa) 懸液,每孔200 μL 培養(yǎng)24 h(5%CO2、37 ℃),棄上清液,加入不同濃度梯度的不含小牛血清的血耳多糖樣品,培養(yǎng)48 h 后,加入WST-1,再培養(yǎng)4 h,于波長450 nm 處測定OD 值。癌細胞抑制率按照公式(1) 計算。
式中:As——試驗組OD 值;
Ac——空白對照組OD 值。
1.3.4 血耳多糖對Raw264.7 的增殖作用
將巨噬細胞Raw264.7 和多糖溶液(100 μL) 放置于96 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)72 h,于波長405 nm 處測定吸光度。采用WST-1 法分析增殖作用,免疫細胞增殖率按照公式(2) 計算。
式中:As——實驗組OD 值;
Ac——空白對照組OD 值。
1.3.5 血耳多糖對Raw264.7 分泌NO 分泌量的影響
將巨噬細胞(濃度為1×106cell/mL) 接種于96 孔培養(yǎng)板中,待細胞貼壁后,棄上清液。添加不同濃度的TSP 溶液或LPS(1 μg/mL,陽性對照),繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后取上清液,加入等體積的Griess試劑,避光下反應10 min,于波長540 nm 處測定吸光度。
1.3.6 血耳多糖對Raw264.7 免疫因子的影響
將不同濃度的多糖溶液及LPS 與巨噬細胞懸液混合,置于96 孔平板上培養(yǎng)48 h 后,用ELISA 試劑盒檢測細胞上清液中的細胞因子(TNF-α、PGE2、IL-1β) 的表達量。每組多糖處理組為3 個重復。
1.3.7 血耳多糖對Raw264.7 免疫因子基因表達的影響
Raw264.7 中加入TSP 或LPS,置于24 孔細胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)18 h。收集細胞,用TRIzol 試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA) 提取總RNA。以提取的RNA 為模板,用oligo-(dT) 20 primer 和Superscript III RT(Invitrogen hCarlsbad hCA hUSA) 制備cDNA,再用PCR 技術進行擴增,產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用凝膠圖像處理軟件掃描分析(Kodak Digital Science hKennesaw hGA hUSA)。
1.3.8 數(shù)據處理
應用SAS 8.0 軟件分析,各試驗組之間的差異用單因素方差分析(ANOVA) 和鄧肯氏復極差(Duncan's multiple-range test) 法進行分析比較。
采用水提醇沉法提取血耳多糖,提取的血耳多糖含糖量為82.13%,含有少量蛋白(5.34%) 及灰分(6.05%),單糖組成表明,血耳多糖主要由葡萄糖(80.52%) 組成,含有少量半乳糖(19.48%)。Wang Zhaojing 等人[6]報道了血耳多糖TSPII 主要由甘露糖、木糖、半乳糖和葡萄糖組成,這主要是由于原料來源、提取純化和檢測方法不同。
血耳多糖的化學組成見表1。
表1 血耳多糖的化學組成/%
巨噬細胞在病原體和抗原的刺激下會啟動免疫應答[7]。因此,試驗以小鼠巨噬細胞Raw264.7 為細胞模型,考查血耳多糖對Raw264.7 免疫增殖及細胞因子分泌的影響,為血耳多糖的開發(fā)利用提供理論依據。結果表明,含有血耳多糖的培養(yǎng)皿中,細胞長勢良好,培養(yǎng)基清澈。
TSP 對巨噬細胞Raw264.7 增殖率的影響見圖1。
圖1 TSP 對巨噬細胞Raw264.7 增殖率的影響
加入TSP 后,小鼠巨噬細胞增殖率提高,且增殖率隨TSP 質量濃度增加而增加,具有質量濃度梯度關系,說明TSP 對小鼠巨噬細胞Raw264.7 無細胞毒性,可以促進小鼠巨噬細胞的增殖。
TSP 對巨噬細胞Raw264.7 中NO 的影響見圖2。
圖2 TSP 對巨噬細胞Raw264.7 中NO 的影響
NO 的分泌是巨噬細胞激活的重要指標,抗癌抗病毒等功能通過釋放NO 來實現(xiàn)[8]。TSP 對小鼠巨噬細胞分泌NO 的影響。由圖2 可知,TSP 能顯著提高小鼠巨噬細胞NO 的分泌,并呈現(xiàn)計量依賴關系。說明TSP 是免疫調節(jié)活性物質,具有免疫調節(jié)活性。
被激活的巨噬細胞能釋放大量的細胞因子,如TNF-α、PGE2 等。細胞因子在免疫反應中起到了至關重要的作用,可以抗擊炎癥、抑制腫瘤等[9-12]。
TSP 對巨噬細胞中TNF-α 釋放的影響見圖3。
圖3 TSP 對巨噬細胞中TNF-α 釋放的影響
在添加TSP 后,巨噬細胞分泌細胞因子TNF-α、PGE2、IL-1β 較陰性對照明顯增加(p<0.01),且生成的細胞因子隨TSP 劑量的增加而增加,呈劑量依賴關系。
TSP 對巨噬細胞中PGE-2 分泌量的影響見圖4,TSP 對巨噬細胞中IL-1β 分泌量的影響見圖5。
圖4 TSP 對巨噬細胞中PGE-2 分泌量的影響
圖5 TSP 對巨噬細胞中IL-1β 分泌量的影響
TSP 對巨噬細胞中iNOS mRNA 表達的影響見圖6,TSP 對巨噬細胞中COX-2 mRNA 表達的影響見圖7。
圖6 TSP 對巨噬細胞中iNOS mRNA 表達的影響
圖7 TSP 對巨噬細胞中COX-2 mRNA 表達的影響
iNOS 和COX-2 的表達由RT-PCR 方法檢測獲得。結果表明,小鼠巨噬細胞在與不同質量濃度TSP培養(yǎng)后,相對于陰性對照組,多糖組的mRNA 表達顯著提高,并且呈現(xiàn)劑量依賴關系。結果表明,TSP促進小鼠巨噬細胞分泌NO 和PGE2 是通過iNOS 和COX-2 基因的表達完成的。
沸水浸提法提取血耳多糖(TSP),TSP 對小鼠巨噬細胞Raw264.7 具有顯著的刺激作用,具有免疫調節(jié)活性,可以作為免疫調節(jié)劑應用在食品和醫(yī)藥行業(yè)中。今后將進一步研究血耳多糖免疫活性的構效關系和免疫通路,以期為開發(fā)血耳多糖保健助劑提供基礎理論依據。