唐婷，周文鳳，王志，朱晨杰，許敬亮，莊偉，應漢杰，歐陽平凱

（1 鄭州大學化工學院，生物 +聯合研究中心，河南 鄭州 450002；2 南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，國家 生化工程技術研究中心，江蘇 南京 211816）

糖類是一種天然、多功能、可再生的有機分子，其催化轉化一方面可以減少自然界生物質資源的浪費，另一方面可以將糖類轉化為附加值高的多種產品，如藥物、食品添加劑、生物質燃料等，廣泛應用于人們日常生活和工業(yè)生產中。在糖類的催化反應中，傳統(tǒng)的化學催化法存在催化效率低、設備腐蝕嚴重、分離困難、污染環(huán)境等問題，阻礙了糖類的高效轉化和實際應用。相比之下，固定化酶催化技術不僅反應條件溫和、選擇性好、專一性高、催化效率高，而且穩(wěn)定性強，便于回收和重復利用，為糖類的催化反應提供了一條綠色高效的途徑，引起了研究者的極大興趣。

糖類結構繁多，催化過程復雜，往往需要多種酶共同參與完成，單酶固定化技術顯然難以滿足需求，因此，發(fā)展基于級聯反應的多酶共固定化技術是糖類催化的必然選擇。多酶共固定化技術是在單酶固定化的基礎上發(fā)展起來的，簡單來說，就是通過物理、化學或生物親和等方法，將多種酶或含酶細胞固定于同一個載體上，使多種酶之間協同作用，充分發(fā)揮其催化特性。在共固定化多酶的級聯催化過程中，一種酶的產物往往是另一種酶的底物，通過縮短底物的傳輸距離和反應時間，減少了中間物的積累和抑制，能夠獲得更高的催化效率和更少的污染物。此外，多酶共固定化技術簡化了多步反應的復雜流程，更易獲得目標產物。

目前，多酶共固定化技術已廣泛應用于食品、醫(yī)藥、能源、環(huán)境保護等行業(yè)，尤其在糖類催化領域的發(fā)展最為廣泛和深入，并形成了很多新成果。鑒于此，本文論述了糖類催化中常用的多酶共固定化方法（包括傳統(tǒng)方法和新型方法），介紹了多酶共固定化技術在糖類催化中的應用，分析了存在的問題并對其發(fā)展前景進行展望，以期為該領域的進一步發(fā)展提供有益參考。

1 糖類催化中常用的多酶共固定化方法

根據酶與載體之間結合方式的不同，多酶共固定化方法可分為多種類型，主要包括發(fā)展較為成熟的4種傳統(tǒng)固定化方法以及近年來出現的一些新型固定化技術。本節(jié)對糖類催化中常用的共固定化方法進行論述，并對其優(yōu)缺點加以討論。

1.1 傳統(tǒng)固定化技術

傳統(tǒng)固定化技術是發(fā)展成熟且目前最為常用的方法。通常包括4種，即吸附法、包埋法、共價法和交聯法，其基本原理及優(yōu)缺點如表1所示。傳統(tǒng)法的應用范圍比較廣，適合大部分的多酶催化體系。但在對某一特定的多酶體系進行共固定化時，要充分考慮載體的特點、多酶的性質、級聯反應的類型以及酶與載體之間的相互作用等多種因素，并在此基礎上選擇合適的方法以實現最佳催化效果。此外，在實際應用中，還可以將多種方法聯用以提高固定化酶的性能，如吸附-交聯法、吸附-共價法不僅能增加酶蛋白負載量，還可以使共固定化多酶的穩(wěn)定性大幅度提高。

表1 目前常用的幾種傳統(tǒng)固定化技術及其比較

總體而言，以上4 種傳統(tǒng)固定化方法各具優(yōu)勢，與游離酶相比，制備的固定化多酶均展現出良好的穩(wěn)定性和重復利用性。然而，這些方法都具有一定的局限性，容易出現酶分子的隨機排列和相互堆積的現象，無法實現酶分子在載體上的精確有序定位，使整體酶活及催化效率受到限制。

1.2 新型固定化技術

為了克服傳統(tǒng)固定化技術的不足，近年來國內外研究者開始探究一些新型固定化方法。通過精確控制不同酶之間的空間取向或相對位置，使酶蛋白活性位點充分暴露或縮短底物分子的傳輸距離，以提高多酶體系的催化效率。其中，應用較為廣泛的是生物固定化法，按照技術原理的不同又可分為金屬親和標簽固定化技術、生物親和固定化技術以及DNA定向固定化技術。

1.2.1 金屬親和標簽固定化技術

金屬親和標簽固定化技術是利用某些氨基酸與過渡金屬離子（Fe、Co、Ni等）形成配位鍵而使酶分子固定在載體上的一種方法。適當的親和標簽可以用于修飾酶分子，并提高固定化酶的催化效率。常用的金屬親和標簽為六組氨酸（6×His），它可以溫和地結合在酶分子的C端或N端，然后與載體上的Ni特異性結合，從而實現酶在載體上的定向固定。

Liu 等利用這一原理將七種酶通過六組氨酸標簽固定在鎳瓊脂糖珠上，并裝填于反應柱中，構建了七酶級聯催化反應體系，用于尿苷二磷酸半乳糖（UDP-半乳糖）的合成。由于多酶之間的臨近效應和協同催化作用，該固定化酶體系表現出較好的催化活性，反應混合物連續(xù)催化48h可將50%的尿苷單磷酸（UMP）轉化為UDP-半乳糖，反應24h的產物產量（1.80g/L）遠大于溶液中的游離酶（1.26g/L）。此外，該法制備的固定化酶穩(wěn)定性良好，是一種利用廉價原材料生產UDP-半乳糖的有效方案。利用相似的工作原理，Pl?課題組將His標簽標記的酮基還原酶（KRED）和葡萄糖脫氫酶（GDH）共固定在含Ni的瓊脂糖基質上，制備了重復間歇流生物反應器。基于雙酶正交級聯反應的原理，GDH 催化所產生的NADP正好滿足了主反應對輔因子的需求，充分發(fā)揮了多酶協同催化的優(yōu)勢。這種精心設計的固定化多酶系統(tǒng)具有比游離酶更好的底物耐受性，反應轉化率可達95%。

金屬親和標簽固定化是一種較為溫和的固定化方法。親和標簽相對較小的尺寸和低電荷量減少了對酶蛋白活性的干擾，并可以實現與功能化載體的特異性結合。目前，很多酶的親和標簽都可以通過基因編碼來完成。但是該法仍存在一些缺點，如載體和酶的修飾過程煩瑣，有時會出現金屬離子易脫落、選擇性低、親和力不高等缺點，且一般適用于活性中心遠離C端或N端的酶分子。

1.2.2 生物親和固定化技術

生物親和固定化技術，是利用某些生物分子間的特異性結合將酶分子固定到載體上的一種新型方法。根據親和分子種類的差異，該技術包括抗原-抗體親和法、親和素-生物素親和法和凝集素-糖類親和法等。

Jia 等基于抗原-抗體親和作用定向固定化酶的原理，制備了電化學免疫傳感器，用于檢測腫瘤標志物。該制作過程主要分為三個部分，如圖1所示：第一部分（a），將硫堇（THI）標記的CEA-抗體及二茂鐵（Fc）標記的AFP-抗體分別結合在鉑納米粒子功能化的氧化石墨烯上，并以此作為共固定化HRP 和GOD 的復合載體；第二部分（b），將金納米粒子（AuNPS）沉積到玻碳電極（GCE）表面，用于結合大量的CEA-抗體和AFP-抗體；第三部分（c），通過加入CEA 和AFP 兩種抗原使兩類復合載體結合，從而將GOD 和HRP 定向固定在復合電極上。在此反應體系中，葡萄糖經GOD和HRP 的級聯催化產生電化學信號，并經由“夾心載體”將免疫信號放大，從而實現了對抗原的快速靈敏檢測。這種免疫檢測器具有良好的選擇性、穩(wěn)定性和重現性，且檢測限較低（CEA 為1.64×10g/L，AFP 為1.33×10g/L），可用于臨床血清的檢測與分析。

圖1 CEA、AFP免疫信號放大生物傳感器示意圖[29]

Mansur小組將蔗糖酶（INV）、GOx、HRP分別與生物素結合形成酶-生物素復合物，然后利用生物素-親和素的相互作用，將三種酶層層組裝，建立了具有3D構架的固定化多酶級聯系統(tǒng)（圖2）。與游離酶相比，這種生物親和固定化酶表現出良好的催化活性和更高的底物親和性，其值僅為游離酶的1/3，這一方面是因為雙酶經固定化后借助載體表面的親水性增加了對底物的親和性，另一方面由于多酶之間的有序排列和構建的反應微環(huán)境促進了底物向酶活性位點的靠近。此外，他們還重點研究了三酶的相對位置對整體活性的影響，結果表明當酶的排列順序不同時，反應體系的催化效率也隨之變化，這種差異可歸因于多種因素，如不同排列方式對酶構象的影響、空間位阻以及級聯反應的途徑等。

圖2 生物素-親和素法固定化INV、GOx和HRP[30]

Chen等以功能化多壁碳納米管（MCNTs）作為載體，利用糖-凝集素之間的親和作用，通過層層組裝的方式構建了HRP-GOD 雙酶傳感器（圖3）。該固定化策略既完成了對單個酶的調控，也實現了雙酶的定向有序組裝。這種MCNT-酶納米復合材料對葡萄糖的線性響應范圍為2.0×10～1.7×10mol/L，檢測限可低至2.5×10mol/L，且具有快速的響應性（響應時間小于5s）、高度的選擇性和良好的穩(wěn)定性，可直接用于測定血清中的葡萄糖。

圖3 基于功能化MCNTs和糖-凝集素特異性作用的雙酶仿生納米電極[31]

與金屬親和標簽固定化技術相比，生物親和固定化的親和作用力更強且具有高度的專一性，因此制備的固定化酶不僅能夠較大程度地保留原始酶活，而且具有較好的穩(wěn)定性。但是由于使用的生物親和標簽價格昂貴，且酶分子改性過程較為煩瑣，因此一般不適用于工業(yè)生產的多酶催化體系。

1.2.3 DNA定向固定化技術

DNA定向固定化（DDI）技術是一種具有高度特異性和位點可選擇性的固定化方法，能夠精確地控制酶的空間位置及方向，調節(jié)多酶之間的相對距離以提高整體催化效率。此外，DNA片段自身具有良好的機械剛性和生物相容性，不僅能夠充分保護酶的活性，還能提高固定化酶的穩(wěn)定性。

最簡單的DNA 定向固定化酶是通過兩條互補的DNA 短鏈來實現的。簡言之，將探針DNA 鏈（P）與載體結合，目標DNA單鏈（C）與酶分子結合，然后利用兩種鏈（P 和C）之間的堿基互補作用實現酶分子在載體上定向固定。Yang課題組通過這種方法，將HRP 和GOx 共固定在多巴胺衍生物改性的磁性納米顆粒上（圖4）。制備的DNA 定向共固定化酶具有較好的底物親和性和優(yōu)異的酶學性能，其值為游離酶的0.73 倍，相對酶活比游離酶高20%，比單酶定向固定化高55%，且能夠利用其磁分離特性進行多次回收利用，在重復催化13 個批次后仍可保持75%的活性。此外，該方案還可以通過調節(jié)載體上兩種官能團的數量來調節(jié)固定化雙酶的比例，以獲得最佳催化效率。這種DNA 定向固定化技術為制備人工多酶復合物提供了一條新途徑，可應用于醫(yī)療診斷、生物醫(yī)學設備和生物技術中。

圖4 多功能磁性納米粒子上的DNA定向固定化多酶[33]

DNA 自組裝技術是另一種較為復雜的DNA 定向固定化方法。它是對多條DNA 鏈進行獨特的空間設計，使之形成多維組裝體，用于定向固定不同的酶分子。Liu 等以自組裝的方式設計了一個DNA 支架，并以酶抑制劑為連接體，將DNA 鏈與GOD、INV和HRP三種酶定向結合在一起。然后在三種酶表面將DNA 支架移除，制備了超分子納米酶膠囊（圖5）。該固定化多酶體系的催化效率是游離酶的24 倍，且納米膠囊能夠保護酶免受外界環(huán)境的破壞，使酶穩(wěn)定性顯著提高。

圖5 DNA自組裝合成納米多酶體系[35]

隨著DNA 納米技術的發(fā)展，出現了一種更高級的自組裝方法——DNA 折紙技術。它是通過復雜的空間設計合成二維或三維的DNA 折紙納米結構，并以此作為載體來實現多酶的定向固定化。其中，最為經典的是Wilner等通過自組裝技術設計了一個六邊形的DNA 骨架（圖6），用于將GOx和HRP 定向固定化。實驗發(fā)現，該反應體系的活性與DNA 骨架的拓撲結構有關，可以通過對DNA鏈進行設計來控制雙酶的相對位置，從而調節(jié)該體系的最大催化活性。相似地，Fu等利用該技術合成了DNA納米磚（圖7），用于固定化HRP和GOx，并探究了兩酶的間距（10～65nm）和位置對酶活性的影響。結果表明，DNA 折紙上固定化酶的酶活普遍大于游離酶，且兩酶間距為10nm時DNA固定化酶的酶活最高（約為游離酶的4 倍），該研究對解釋酶活與位置的相關機理具有重要意義。

圖6 GOx和HRP在“二六邊形”和“四六邊形”上的固定化[37]

圖7 GOx和HRP在DNA納米結構上的自組裝[38]

不難看出，DNA 定向固定化技術在提高酶活方面效果顯著。這一方面得益于DNA 分子優(yōu)良的生物相容性和精確的定位能力，避免了多酶分子之間的堆積重疊，保證酶活性位點的充分暴露；另一方面，由于DNA 結構具有可設計性，能夠方便地調節(jié)多酶的比例、多酶之間的距離以及不同酶分子的空間取向，對整體酶活具有顯著促進作用。

綜上所述，新型固定化技術具有溫和、高效、精確定位等特點，因此通常比傳統(tǒng)固定化技術具有更好的催化活性。然而，由于生物標簽試劑和DNA 鏈的操作要求及應用成本都相對較高，其普適性還有賴于生物技術和DNA技術的進一步發(fā)展。目前，新型固定化技術多用于醫(yī)學檢測、生物分析及傳感器等少數領域，而對于一般的多酶催化體系并不常用。

2 多酶共固定化技術在糖類催化中的應用

多酶共固定化技術在糖類催化中的應用源于20 世紀中期。起初，人們主要關注于共固定化細胞對糖類的催化作用，后來又開始探索多種新型固定化方法，其部分應用如表2所示。目前，多酶共固定化技術發(fā)展日漸成熟，在糖類催化中的應用也非常廣泛，常見的有淀粉的水解、纖維素的利用以及功能性糖的合成等。

表2 多酶共固定化技術在糖類催化中的應用

2.1 多酶共固定化技術在淀粉水解中的應用

淀粉是我國產量最多的可再生能源之一。該行業(yè)正面臨著初級產品用量過剩、經濟價值低的困境，而其水解產物葡萄糖、麥芽糖等應用極為廣泛，在食品、醫(yī)療、化工等行業(yè)發(fā)揮著不可或缺的作用。利用多酶共固定化技術對淀粉進行酶解，使其轉化為高價值產品，推動行業(yè)轉型升級，已成為當今發(fā)展的必然趨勢。

共價法和交聯法是淀粉催化中常用的多酶共固定化方法。Torabizadeh等以戊二醛為交聯劑，將α-淀粉酶和麥芽糖淀粉酶共固定在賴氨酸改性的磁性FeO納米顆粒上，用于催化淀粉轉化為麥芽糖。與游離酶相比，該固定化雙酶保留了84%的活性，在95℃催化時的值降低了1.5倍，熱穩(wěn)定性增加了1.5倍，且重復使用10個循環(huán)后仍可保留80.4%的原始活性。這種具有高穩(wěn)定性和重復使用性的納米生物催化劑具有實際生產價值，為淀粉轉化為麥芽糖的工業(yè)生產提供了有效方案。相似地，Talekar 等以2%的戊二醛為交聯劑，將葡萄糖淀粉酶和普魯蘭酶共固定化，在間歇條件下，淀粉水解的轉化率為100%，重復使用8 次后兩酶分別保留90%和85%的活性。在此基礎上，該課題組用同樣的方法制備了三種酶（α-淀粉酶、支鏈淀粉酶和葡糖淀粉酶）的交聯聚集體，并比較了不同多酶體系混合物的催化效果。結果表明，多酶交聯聚集體的轉化率（100%）比單酶交聯聚集體混合物（60%）、游離酶混合物（40%）高很多，并且重復使用5個循環(huán)活性不發(fā)生明顯變化。

與共價法相比，包埋法在操作上更為簡單方便。Zhang 等受線粒體內代謝酶空間結構和貽貝黏附蛋白多功能特性的啟發(fā)，通過層層組裝的方式，將葡糖苷酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶和共包埋于多巴胺（PDA）微囊的不同位置（圖8）。用于催化淀粉水解為葡萄糖。由于PDA 微膠囊固有的傳質阻力，固定化多酶的催化速率要比游離酶慢。但是，其最大產率（53%）大于游離酶（39%），這是因為PDA 的親水性和良好的生物相容性為多酶級聯體系提供了一個合適的反應微環(huán)境，從而提高了整體催化活性。Salgaonkar 等用一鍋共沉淀法制備了淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的復合金屬有機骨架（MOF），用于將淀粉轉化為葡萄糖。基于MOF的支撐保護作用，該固定化酶復合物具有良好的穩(wěn)定性，在儲藏24 天后仍保留89%的活性，遠高于游離態(tài)。

圖8 多巴胺微膠囊構建的固定化多酶體系[47]

在載體比表面積較大的情況下，吸附法也是一種較好的選擇。Han等以多孔微球作為載體，利用吸附法共固定化α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶、肌醇1-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶，用于催化淀粉合成肌醇。該共固定化多酶體系的催化速率與游離酶相當，且具有更高的熱穩(wěn)定性，使用7個批次后仍保留45.6%的相對產率，而游離酶3 個批次后僅保留13.3%的相對產率。這種多孔微球共固定化酶可用于生物制造，對體外合成酶系統(tǒng)的工業(yè)應用具有重要意義。

除單一固定化法外，還可以將多個方法結合使用。Dai將包埋法和吸附法聯用，使葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶分別固定于藻酸鈣珠粒的內表面和外表面，兩酶的固定效率分別為45%和54%。這種固定化策略可以通過減少中間過程的繁雜步驟數來提高淀粉水解過程的效率，從而降低酶費用及加工成本。

綜上所述，對于淀粉水解的多酶體系，共價固定法最常用。雖然共價固定后的多酶催化體系活性有所損失，但仍保持了高效的催化效率和良好的穩(wěn)定性，具有工業(yè)化應用的潛力。包埋法和吸附法能較大程度地保留淀粉酶的活性，但是由于存在底物傳質限制和酶易脫落的問題，催化效率和操作穩(wěn)定性往往不如共價固定化法。

2.2 多酶共固定化技術在纖維素處理中的應用

木質纖維素可以形成大部分植物的細胞壁和結構組織，是全球最豐富的可再生農業(yè)原料，其主要成分是纖維素。在過去幾十年中，隨著各工業(yè)部門對水解纖維素產品的需求量增加，纖維素酶的應用引起了廣泛關注。在纖維素的水解過程中，往往需要多種酶協同催化才能獲得目的產物，然而游離酶體系往往成本高、穩(wěn)定性差且難以回收。因此，在實際工業(yè)應用中，將多種游離纖維素酶進行共固定化以提高生產效益是十分必要的。

Cho 等以金納米粒子作為載體（AuNP），共固定半胱氨酸標記的三種纖維素酶（內葡聚糖酶、外葡聚糖酶、β-葡糖苷酶）用于催化纖維素水解（圖9）。結果表明，該固定化體系的活性和穩(wěn)定性顯著高于游離纖維素酶混合物。在進一步研究中，將這三種酶固定在金-二氧化硅復合納米粒子上（Au-MSNP），用于連續(xù)生產葡萄糖。研究發(fā)現，由于SiO的存在減少了金納米粒子間的相互作用，Au-MSNP@纖維素酶具有更好的催化效率，生成的纖維二糖和葡萄糖的產率分別增加了158%和179%，且在重復使用7 次后仍保留90%的催化活性。

圖9 在AuNP和Au-MSNP上固定化纖維素酶[52]

相似地，Yuan 等用磁性納米粒子共固定化三種纖維素酶，水解植物細胞壁的纖維素以回收花青素。固定化酶顯示出優(yōu)越的穩(wěn)定性和重復使用性，即使在儲存60 天后，幾乎保持所有的催化活性，而游離酶在30 天內失去全部活性。此外，還表現出良好的催化能力，可用于回收5 種花青素，降低了工業(yè)應用酶的成本。

Muley 等利用溶劑沉淀法從發(fā)酵液中回收纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶，然后以戊二醛為交聯劑，將這三種酶共固定在APTES 改性的FeO納米粒子上。三種酶的酶活回收率分別為80.25%、84.76%和75.62%，與游離酶相比具有更好的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性，最適溫度由50℃升高為60℃，在5℃下可以穩(wěn)定保存36 天，且在循環(huán)使用4次后仍可保留90%以上的催化活性。這種磁性多酶復合物性能優(yōu)良，已成功用于黑胡椒中胡椒堿的提取、甘蔗細胞原生質體的制備以及木瓜汁的澄清等。與之相似，Kumari 課題組以FeO納米粒子作為載體，共固定化木聚糖酶、纖維素酶和淀粉分解葡聚糖轉移酶。實驗結果表明，三種酶的固定效率分別為92%、45%和93%。制備的共固定化多酶在4℃下儲存45天可以保持66%的催化活性，重復利用13 次后仍具有50%以上的活性。該多酶復合物也可用于農業(yè)廢棄物的處理，將生物質中的纖維素或半纖維素轉化為不同種類的單糖，或進一步處理轉化為乙醇等染料。

纖維素水解中的酶體系大多都是由不同類型的纖維素酶構成的。與游離酶相比，共固定化后的多酶體系表現出明顯的優(yōu)勢，即具有非常好的儲存穩(wěn)定性和良好的重復使用性，這在一定程度上為工業(yè)化生產奠定了基礎。

2.3 多酶共固定化技術在功能性糖合成中的應用

功能性糖是對人體健康有改善促進作用的一些糖類，主要包括功能性低聚糖、功能性膳食纖維和功能性糖醇。功能性糖可以作為蔗糖的替代品，不僅具有抗齲齒、降血壓、保護腸道的生理功效，還能預防癌癥、糖尿病、肥胖癥、心血管疾病等多種疾病的發(fā)生。目前，利用多酶級聯催化法制備功能性糖是一種綠色高效的途徑。

低聚半乳糖是一種具有天然屬性的功能性寡糖，可促進腸道菌群的生長，是最有前途的益生元之一。Li 等將β-半乳糖苷酶固定在海藻酸鈣上，催化乳糖生成低聚半乳糖。在此基礎上，進一步用固定化的釀酒酵母細胞對產物進行反復純化，獲得了高純度的低聚半乳糖。但是由于兩部分固定化過程是分開進行的，這種方法在操作上較為煩瑣且獲得的產率較低。近些年，Aburto等也對該催化體系進行了研究，但制備固定化酶的方法與Li課題組大不相同。簡單來說，先制備β-半乳糖苷酶的交聯酶聚集體，然后將其與釀酒酵母細胞共固定在海藻酸鈣凝膠中。結果表明，酶和細胞的共固定化復合物不僅易于回收和重復使用，而且獲得了與游離酶（23.3%）相當的產物收率（25.7%），是一種從乳糖中提取低聚半乳糖的創(chuàng)新工藝。然而，由于酵母細胞在操作過程中易失活，使催化性能受到限制，所以需進一步改進工藝以提高酵母細胞的穩(wěn)定性。

低聚乳果糖是另一種促進腸道菌群增殖的功能性糖，可以作為甜味劑食用，在食品行業(yè)應用廣泛。Long 等用溶膠-凝膠法共固定β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶，用于催化蔗糖/乳糖混合液生成低聚乳果糖。與游離酶相比，該固定化雙酶體系具有85.3%的初始活性和較好的操作穩(wěn)定性，在使用15 次之后仍保留78.5%的活性。這種共固定化雙酶體系的低聚乳果糖的產量高達160.8g/L，可用于食品工業(yè)中高純度低聚乳果糖的連續(xù)生產。

低聚異麥芽又稱益生元，具有促進消化吸收、增強免疫力、降低血脂的功能。?l?er 等用海藻酸鈣膠囊法共固定化葡聚糖蔗糖酶（DS）和葡聚糖酶（DN），并以蔗糖為原料制備低聚異麥芽糖。該法簡單有效，不僅具有較高的固定化效率（71%），在重復使用20 個循環(huán)或儲存一個月后仍可保持其催化活性，具有工業(yè)化生產低聚麥芽糖的潛力。

2.4 多酶共固定化技術在糖類下游產品合成中的應用

糖類的催化產物經進一步加工，還可轉變?yōu)槎喾N化合物，不僅可用于補充人體營養(yǎng)物質（如小分子糖、微量元素等），還可以作為工業(yè)生產的原料，廣泛地用于各行各業(yè)中。

5-羥甲基糠醛是一種以糖類為原料合成的有機物，其化學性質活潑，可以通過氧化、氫化和縮合等反應轉化為多種化學品或液體染料，應用極為廣泛。Wu 等將半乳糖氧化酶、過氧化氫酶和辣根過氧化物酶共固定化在Cu(PO)納米花中，構建了一條由5-羥甲基糠醛生成2,5-二甲?；秽摹熬G色路線”。研究發(fā)現，游離酶易受高濃度的5-羥甲基糠醛影響而失去活性，但共固定化三酶表現出更好的底物耐受性和熱穩(wěn)定性。此外，共固定化三酶催化生成2,5-二甲?；秽漠a率（95.7%）是單獨固定化酶（90.4%）的1.06 倍，這是因為三酶的共定位減少了底物傳輸的距離，促進了級聯反應的有序進行。在以后的研究中，可以進一步將化學催化法和多酶共固定化技術相結合，探究將木質纖維素直接轉化為2,5-二甲?；秽母咝窂?。

葡萄糖酸是一種多功能有機化工產品，其鹽類可廣泛應用于制藥、農業(yè)、食品、醫(yī)藥和混凝土行業(yè)。據報道，糖類的酶法催化是生產葡萄糖酸的有效途徑之一。Han 等用纖維素酶水解脫木質素的玉米棒殘渣（DCCR），進而在共固定化葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶的催化下，生成葡萄糖酸鈉。該固定化酶在最佳條件下反應56h 可得166.87g/L 葡萄糖酸鈉，產物收率為98.24%，重復使用6次后仍能保持60%以上的催化活性。在此研究的基礎上，Yu 等將纖維素酶、葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶三種酶共固定在Eudragit L-100 上，用于生成葡萄糖酸。通過確定制備條件、探究酶學性質和優(yōu)化催化條件，最終生成的葡萄糖酸的產量達0.28mg/mg，玉米秸稈中纖維素的轉化率為61.41%。該共固定化多酶系統(tǒng)適用于將玉米秸稈一鍋轉化為葡萄糖酸。

木糖酸是維他命C的重要代謝產物之一，也是許多重要化學過程必不可少的中間體。Bachosz等利用磁性納米粒子共固定化木糖脫氫酶和乙醇脫氫酶，用于將木糖轉變?yōu)槟咎撬?，并使原位輔因子再生。共固定化酶生成的木糖酸濃度比游離酶高25%，并具有良好的穩(wěn)定性和重復使用性：保存20天后活性保留了60%左右，連續(xù)5個反應循環(huán)后活性仍大于65%。

乙醇是重要的生物質燃料和化學溶劑，廣泛用于醫(yī)療衛(wèi)生、食品工業(yè)、國防化工等行業(yè)。Altuntas 等將淀粉葡糖苷酶和運動發(fā)酵單胞菌細胞共固定在海藻酸鈉凝膠中，以廉價的淀粉作為底物，在連續(xù)攪拌的生物反應器中同時糖化和發(fā)酵生成乙醇。該生物催化劑具有較好的反應活性，在最佳條件下，底物轉化率可達98%。與此不同，Silva小組先將葡萄糖異構酶固定在殼聚糖上，然后再進一步與釀酒酵母共固定于藻酸鈣凝膠中，在連續(xù)生物反應器中將木糖轉化為乙醇。實驗結果表明，該共固定化多酶具高蛋白負載量（0.03～0.068g/g）、高產物收率（約100%）和高酶活回收率（>90%），且最佳活性幾乎是商用酶的2倍，可滿足由木糖為底物連續(xù)生產乙醇的需要，具有工業(yè)應用的潛力。

2.5 多酶固定化技術在人工光合作用中的應用

二氧化碳是導致溫室效應的主要氣體之一。從資源利用和能源合成的戰(zhàn)略角度來看，利用可再生能源將二氧化碳轉化為化學品具有重要意義，不僅能夠減少碳排放緩解溫室效應的危害，而且可以將低價值的化合物轉化為具有高附加值的產品。近年來，隨著多酶級聯系統(tǒng)的迅速發(fā)展，人工光合作用應運而生，通過利用每種酶的特性和多酶之間的協同效應，將CO高效地轉化為一些重要的化學原料，如甲醛和甲醇等。因此，人工光合作用作為一種創(chuàng)新型方法，近年來受到研究者的廣泛關注。

Huang基于胞外酶工程原理，通過組合自然界存在的多種酶，催化自然界不存在的暗反應途徑。該過程使用H或電能再生NADH驅動CO轉化為糖或淀粉，避開了人工光合磷酸化再生ATP 的難題，理論效率較高。如果進一步與太陽能光伏技術或者產氫技術結合，就能實現人工光合作用，將CO轉化為了糖類，成為一種工業(yè)糧食生產的潛在方法。該研究具有理論創(chuàng)新性，但其催化過程存在酶穩(wěn)定性的問題。多酶共固定化技術可以很好地改善這一困境，即通過對反應過程中的多種酶進行固定化操作，使酶的穩(wěn)定性和反應轉化數顯著提高，進而提高糖類產率。因此，基于多酶共固定化技術的原理，Zhou等設計了一種新穎的方案，通過將中-四（羧基苯基）卟吩（TCPP）和ZIF-8 成功結合在一起，以TCPP 用作光催化劑，ZIF-8 作為甲醛脫氫酶（FaldDH）和甲酸脫氫酶（FateDH）的固定化載體，首次構建了光催化多酶級聯仿生固碳系統(tǒng)（圖10）。結果表明，1g/L 3%的TCPP@ZIF-8在可見光下反應3h，可使NADH 的還原率高達75.04%，且當FateDH∶FaldDH=2∶1 時，甲醛產率為7.74μmol/L。此外，該復合體系經過10 批次重復使用后，可保留52.93%的催化活性。這是人工光合作用研究中的一次創(chuàng)新，為人工催化體系與多酶固定化體系的結合提供了實踐基礎。

圖10 光催化多酶級聯系統(tǒng)示意圖[82]

3 總結與展望

糖類是天然的可再生能源，其催化產物具有巨大的應用潛力。在過去十幾年里，多酶共固定化技術迅速發(fā)展，在糖類的催化反應中應用廣泛，如多糖的水解、功能性寡糖的合成以及糖類下游產品的合成等，越來越受到研究者的關注。

誠然，多酶共固定化技術具有諸多優(yōu)勢，不僅使酶分子具有良好的穩(wěn)定性和重復利用性，同時充分發(fā)揮了多酶之間協同催化的性能，提高了催化效率。然而，需要指出的是，由于糖類的結構繁多，多酶催化體系復雜，并沒有一種通用的、普適性的方法可供使用，對于某一已知的催化體系，要綜合考慮其實際情況，理性地選擇合適的方法。此外，多酶共固定化技術在實際運用中會出現很多問題，如固定化后酶活損失嚴重、酶與載體結合不牢固，產物回收率低等。針對以上不足，無論在以后的基礎研究還是應用研究中，應注意以下幾個方面：①在固定化過程中，要充分考慮多種因素，選擇一種最佳的固定化方案，以最大限度地保留酶活并提高反應系統(tǒng)的穩(wěn)定性；②對于共固定化后傳質受限的多酶體系，可為其針對性地選擇合適的載體，充分利用底物通道或微環(huán)境提高級聯反應的催化效率；③若多酶體系中含有固定化細胞，要設法改變其操作穩(wěn)定性，以提高整體的操作穩(wěn)定性和重復使用性；④在一些情況下，可將多種方法聯合使用以提高固定化酶的性能；⑤靈活利用多種表面分析技術對固定化過程的有效性進行檢測。

目前，多酶共固定化技術在糖類催化中的工業(yè)應用還比較少，主要是因為酶成本比較高以及固定化技術的工業(yè)應用還不夠成熟。在今后，多酶共固定化技術會面臨更多新挑戰(zhàn)和發(fā)展機會，相信隨著科學研究的不斷深入，技術的不斷優(yōu)化，多酶共固定化技術將日益成熟完善，并在糖類催化的實際應用中發(fā)揮巨大的作用，為工業(yè)生產帶來一次巨大蛻變。