劉夢迪　倪守飛　王月雪　母景嬌　蔡倩　趙彥宏　王艷芳

摘要：【目的】對大麥TIFY基因家族成員進行鑒定及表達分析，為進一步探究TIFY基因家族在大麥生長發(fā)育與脅迫響應(yīng)中的作用機理打下基礎(chǔ)。【方法】基于TIFY家族蛋白的保守域特征，利用HMMER從大麥中鑒定TIFY基因家族成員，利用采用生物信息學(xué)軟件對其理化性質(zhì)、保守基序、特征結(jié)構(gòu)域、順式作用元件、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化及表達模式進行預(yù)測分析?！窘Y(jié)果】從大麥中鑒定出15個HvTIFYs基因（HvTIFY1～HvTIFY15），分布于5條染色體上，且大多數(shù)基因在染色體上成簇分布。15個HvTIFYs蛋白均具有TIFY家族蛋白的特征結(jié)構(gòu)域（TIFY），根據(jù)所含保守結(jié)構(gòu)域的不同，可分為ZML（4個）和JAZ亞族（11個），且親水性蛋白（14個）和偏堿性蛋白（11個）居多，但均定位于細胞核;二級結(jié)構(gòu)相似度較高，均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成，除HvTIFY7蛋白外，其余蛋白二級結(jié)構(gòu)所占比排序：無規(guī)則卷曲>α-螺旋>β-轉(zhuǎn)角。HvTIFYs基因結(jié)構(gòu)存在明顯差異，其中，JAZ亞族11個基因的內(nèi)含子數(shù)為0～6;ZML亞族4個基因的內(nèi)含子數(shù)為6～7個，系統(tǒng)發(fā)育進化樹上相鄰分支的基因具有較相似的基因結(jié)構(gòu)。HvTIFYs基因啟動子區(qū)域富含光、激素和脅迫等順式作用元件，種類及分布均呈多樣性。5個物種的79條TIFY蛋白分為4個組，恰好與TIFY家族的4個亞族對應(yīng)，其中，ZML、TIFY和JAZ亞族包含單、雙子葉植物的TIFY蛋白，而PPD亞族僅含有雙子葉植物的TIFY蛋白。15個HvTIFYs基因在不同組織器官中的表達量存在明顯差異，其中HvTIFY1、HvTIFY2和HvTIFY8基因在8個組織中的表達量均較高，HvTIFY10和HvTIFY15基因表達量中等，HvTIFY6基因表達量較低;HvTIFY11基因不表達。15個基因在根的不同組織中對鹽脅迫的敏感程度不同?！窘Y(jié)論】從大麥中鑒定出的15個HvTIFYs基因存在一定的功能分化，具有明顯的組織和時空特異性，推測其在大麥逆境響應(yīng)和激素調(diào)節(jié)中具有重要調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 大麥;TIFY基因家族;鑒定;生物信息學(xué);表達分析

中圖分類號： S512.303.53? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）02-0417-13

Identification and expression analysis of TIFY gene family members in barley

LIU Meng-di NI Shou-fei WANG Yue-xue MU Jing-jiao CAI Qian ZHAO Yan-hong1 WANG Yan-fang

（1Agricultural College， Ludong University/Key Laboratory of Molecular Module Breeding for High Yield and Stress Resistance of Crops in Colleges and Universities of Shandong Province， Yantai， Shandong? 264025， China;

2College of Life and Science，Ludong University， Yantai， Shandong? 264025， China）

Abstract：【Objective】The identification and expression analysis of barley TIFY gene family members could lay a foundation for the further exploration and understanding of the mechanism of TIFY gene family in barley growth and development and response to stress. 【Method】TIFY gene family members were identified from barley by HMMER based on their conserved domain characteristics. Their physicochemical properties， conserved motifs，characteristic domains， cisac-ting elements，gene structure，phylogeny and expression patterns were predicted using bioinformatics software. 【Result】In this study，15 TIFY genes （HvTIFY1-HvTIFY15） were identified in barley，which were distributed on 5 chromosomes， some of them in clusters. The 15 HvTIFY proteins had the characteristic domain （TIFY） of the TIFY family. According to their different contents of conserved domains， they could be divided into ZML（4） and JAZ（11） subgroups. Most of them were hydrophilic （14） and lightly basic （11） proteins，but all of them were located in the nucleus. With the exception of HvTIFY7， the similarity of secondary structure was high， which was proportionally composed of random coil>α-helix>β-angle. There were， however， obvious differences in the structure of HvTIFYs genes. The number of introns ranged from 0 to 6 for the 11 genes in the Jaz subfamily and from 6 to 7 for the 4 genes in the ZML subfamily. The promoter regions of HvTIFY genes were rich in cis-acting elements such as light， hormone and stress， and its species and distribution were diverse. The 79 TIFY proteins of 5 species were divided into 4 subfamilies. The ZML，TIFY and JAZ subfamilies contain TIFY proteins of monocotyledons and dicotyledons， while the PPD subfamily only contains TIFY proteins of dicotyledons. There were significant differences in the expression of the 15 HvTIFY genes in different tissues and organs，in which HvTIFY1， HvTIFY2 and HvTIFY8 genes were highly expressed in 8 tissues，HvTIFY10 and HvTIFY15 genes were modera-tely expressed， HvTIFY6 expression was low and HvTIFY11 expression was not detected. Different HvTIFY genes displayed different sensitivities to salt stress in different root tissues. 【Conclusion】There is some functional differentiation in the 15 HvTIFY genes identified from barley with obvious tissue and spatiotemporal specificity， which are speculated to have important regulatory roles in hormone regulation and the barley response to adverse conditions.

Key words： barley; TIFY gene family; identification; bioinformatics; expression analysis

Foundation items： National Key Research and Development Program of China（2019YFD1005002-0304）

0 引言

【研究意義】大麥（Hordeum vulgare）是全球普遍栽培的第四大禾谷類作物，在食用、飼料、釀造業(yè)等多個方面均具有重要用途（龔謹，2020;郭銘，2021），但其在生長過程常因遭遇諸多逆境脅迫而導(dǎo)致減產(chǎn)，如何提高大麥的抗逆能力已成為研究熱點。TIFY基因家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，因其編碼的蛋白均具有高度保守的TIFY結(jié)構(gòu)域而得名（Vanholme et al.，2007;Zhu et al.，2013）。該基因家族不僅與植物生長發(fā)育密切相關(guān)，而且在非生物脅迫（低溫、干旱和高鹽）及激素調(diào)節(jié)（茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)）等多種生物學(xué)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用（Zhang et al.，2015a;劉俊等，2021）。對大麥TIFY基因家族進行系統(tǒng)鑒定及表達分析，并解析TIFY基因家族在大麥應(yīng)對逆境脅迫中的作用機制，對培育高產(chǎn)抗逆的大麥品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】自Nishiiet等（2000）首次從擬南芥中發(fā)現(xiàn)了TIFY基因家族成員AtTIFY1（也稱為AtZIM）以來，陸續(xù)從擬南芥（Vanholme et al.，2007）、水稻（Ye et al.，2009）、葡萄（Zhang et al.，2012）、野生大豆（Zhu et al.，2013）、二穗短柄草（Zhang et al.，2015）、玉米（Zhang et al.，2015b）、棉花（Zhao et al.，2016）、小麥（Xie et al.，2019）、大麻（溫東等，2020）、柑桔（張滬等，2020）和杜仲（劉俊等，2021）中分別鑒定出18、20、19、34、21、30、30、63、3、14和14個TIFY基因。TIFY蛋白除了包含TIFY結(jié)構(gòu)域外，通常還含有GATA、CCT、PPD和Jas結(jié)構(gòu)域。根據(jù)蛋白包含保守結(jié)構(gòu)域的不同，可將其分為4個亞族：TIFY、PPD、JAZ和ZML。其中，只含有TIFY結(jié)構(gòu)域的蛋白歸屬于TIFY亞族;同時包含TIFY和Jas結(jié)構(gòu)域的蛋白歸屬于JAZ亞族;同時含有TIFY、GATA和CCT結(jié)構(gòu)域的蛋白歸屬于ZML亞族;除包含TIFY結(jié)構(gòu)域外，N端還含有1個PPD結(jié)構(gòu)域的蛋白歸屬于PPD亞族（White，2006;Chini et al.，2007;Yan et al.，2007;Cai et al.，2014;Tian et al.，2019）。前人研究發(fā)現(xiàn)，TIFY基因家族成員與植物的生長發(fā)育密切相關(guān)，而且在逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。例如，擬南芥AtTIFY1基因?qū)θ~柄和下胚軸的伸長具有重要調(diào)控作用（Shikata et al.，2004），AtPPD1和AtPPD2基因?qū)θ~片生長具有重要調(diào)控作用（White，2006）;香蕉MaTIFY1基因被丙烯誘導(dǎo)表達后可加快果實成熟（羅冬蘭等，2017）;水稻OsJAZ1基因通過與OsMYC2和OsCOI1b相互作用調(diào)控花的發(fā)育和根的伸長，其核心序列被替換或刪除均會影響花和根發(fā)育過程中茉莉酸信號的特異性和敏感性（Chini et al.，2007;Yan et al.，2007;Cai et al.，2014;Tian et al.，2019）;葡萄的19個VvTIFY基因?qū)ι锩{迫（如白粉病菌和葡萄卷葉病毒GLRaV-3）并不敏感，但環(huán)境（如低溫、干旱和高鹽等）脅迫和激素（如茉莉酸和脫落酸等）脅迫能誘導(dǎo)部分VvTIFY基因的差異表達（Zhang et al.，2012）;大豆TIFY10基因在響應(yīng)堿脅迫中發(fā)揮重要調(diào)控作用（Zhu et al.，2014）;二穗短柄草中的部分TIFY基因參與茉莉酸信號通路，響應(yīng)至少一種非生物脅迫（如干旱、高鹽、低溫、高溫等）（Zhang et al.，2015a）;核桃PnJAZ1基因表達可提高種子萌發(fā)率和早期發(fā)育中的鹽脅迫耐受性（Liu et al.，2019）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，TIFY基因家族在很多物種中已被鑒定出來，但鮮見有關(guān)大麥TIFY基因家族成員鑒定及表達分析的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用生物信息學(xué)方法鑒定出大麥TIFY基因，分析其理化性質(zhì)、保守基序、蛋白結(jié)構(gòu)、順式作用元件、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化及基因表達模式，為解析該基因家族在大麥生長發(fā)育和逆境脅迫中的功能提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 TIFY基因家族的鑒定及定位

從EnsemblPlant數(shù)據(jù)庫（http：//plants.ensembl.org/index.html）和UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中下載大麥所有的蛋白序列，從Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）提取TIFY家族蛋白特征種子文件（PF06200）?；诜N子文件PF06200，利用HMMER從已下載的大麥蛋白質(zhì)序列中篩選出候選TIFY蛋白序列，然后利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對候選大麥TIFY蛋白進一步鑒定及驗證。

從Phytozome數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）獲取大麥TIFY基因在染色體上的位置信息，然后用MapChart繪制大麥TIFY基因的染色體位置圖。使用Cell-PLoc2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）對大麥TIFY蛋白進行亞細胞定位預(yù)測。

1. 2 蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用Protparam（https：//web.expasy.org/protpa-ram/）預(yù)測大麥TIFY蛋白的基本理化性質(zhì)。使用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測大麥TIFY蛋白的二級結(jié)構(gòu)。利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測大麥TIFY蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1. 3 蛋白保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

使用MEME（http：//memesuite.org/tools/meme）預(yù)測大麥TIFY蛋白的保守基序（motif），motif最大數(shù)值設(shè)定為8。利用GSDS（http：//gsds.cbi.pkuedu.cn/）分析其基因結(jié)構(gòu)。

1. 4 順式作用元件分析

從Phytozome數(shù)據(jù)庫中提取大麥TIFY基因的起始密碼子上游2000 bp序列，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測基因啟動區(qū)域的順式作用元件，最后用TBtools繪制順式作用元件圖譜（Chen et al.，2020）。

1. 5 系統(tǒng)發(fā)育及共線性分析

利用MEGA-X中的ClustalW模塊對大麥TIFY蛋白進行多序列比對（Tamura et al.，2011），并采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，其中Bootstrap設(shè)置為1000，其他參數(shù)采用默認值。采用同樣方法，基于來自擬南芥、野生大豆、水稻、二穗短柄草和大麥的79條TIFY蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析，利用Evolview v3（https：//www.evolgenius.info/evolview/#login）繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹。利用TBtools分別分析大麥與擬南芥、大麥與水稻之間TIFY基因的共線性。

1. 6 TIFY家族表達分析

基于Expression Atlas數(shù)據(jù)庫（https：//www.ebi.ac.uk/gxa/experiments）的大麥RNA-Seq表達數(shù)據(jù)（E-MTAB-2809和E-MTAB-4634）進行TIFY基因表達模式分析，其中E-MTAB-2809包含了TIFY基因在大麥的根、花序（1 cm）、花序（5 mm）、節(jié)間、穎果（15 d）、穎果（5 d）、幼苗和胚芽等8個組織中的RNA-Seq數(shù)據(jù)，從中獲得了大麥TIFYs基因的FPKM值，然后使用Log2歸一化FPKM值;E-MTAB-4634包含了TIFY基因在NaCl脅迫后在大麥根尖、根伸長區(qū)和根分生區(qū)基因表達的RNA-Seq數(shù)據(jù)，從中獲得TIFY基因的Log2（Fold-change）值表示其表達量的倍數(shù)變化。最后，用TBtools繪制大麥TIFY基因的表達熱圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 大麥TIFY基因家族的鑒定及分析

利用HMMER從大麥中鑒定出15個TIFY基因家族成員，根據(jù)其在染色體上的位置命名為HvTIFY1～ HvTIFY15，長度為1224～6245 bp，編碼區(qū)（CDS）長度為285～1407 bp（表1）。這15個HvTIFYs基因不均勻地分布在5條大麥染色體上（圖1），其中2H、5H和6H染色體各含有2個HvTIFYs基因，4H和7H染色體上分別含有5和4個HvTIFYs基因。大多HvTIFYs基因在染色體上成簇分布，每簇內(nèi)包含2～3個HvTIFYs基因，如5H染色體上的HvTIFY8和HvTIFY9基因簇，7H染色體上的HvTIFY12、HvTIFY13和HvTIFY14基因簇。

上述HvTIFYs基因編碼的15個HvTIFYs蛋白均具有典型的的特征結(jié)構(gòu)域（TIFY）。15個HvTIFYs蛋白由94～468個氨基酸殘基組成，相對分子量為10.0～50.3 kD;理論等電點（pI）為4.7～10.4，其中，大于7.0的蛋白有11個（表2），說明偏堿性蛋白居多;除HvTIFY7蛋白外，其余14個大麥TIFYs蛋白均為親水性蛋白。蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（表2）顯示，大麥TIFY蛋白的二級結(jié)構(gòu)相似度較高，均含α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，均不含β-折疊，除HvTIFY7蛋白外，其余蛋白的二級結(jié)構(gòu)所占比例排序為：無規(guī)則卷曲>α-螺旋>β-轉(zhuǎn)角。三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果（圖2）表明，無規(guī)則卷曲和α-螺旋在維持三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中發(fā)揮主要作用，β-轉(zhuǎn)角主要起修飾作用。HvTIFY1、HvTIFY9和HvTIFY13蛋白中均具有1個典型的鋅指結(jié)構(gòu)，即1個α-螺旋與2條反向的β-轉(zhuǎn)角平行。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，15個大麥TIFYs蛋白均被定位于細胞核中（表2），證實了TIFY蛋白是一類轉(zhuǎn)錄因子。

2. 2 大麥TIFY家族基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

由圖3可知，相鄰分支的HvTIFYs基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，JAZ亞族的11個HvTIFYs基因的內(nèi)含子數(shù)為0～6，其中HvTIFY6、HvTIFY13和HvTIFY14基因不含任何內(nèi)含子;ZML亞族的4個基因（HvTIFY3、HvTIFY4、HvTIFY10和HvTIFY15）的內(nèi)含子數(shù)為6～7個（圖3-B），推測這2個亞族HvTIFYs基因在進化過程中分別發(fā)生了內(nèi)含子的丟失和插入;內(nèi)含子數(shù)量越多，表示基因可形成剪接體的潛在能力越高，相對于JAZ亞族的HvTIFYs基因來說，ZML亞族的HvTIFYs基因可形成多種剪接體的潛在能力更高。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)有7個HvTIFYs基因的TIFY保守域?qū)?yīng)編碼序列存在同一個外顯子內(nèi)，而另外8個HvTIFYs基因的TIFY保守域?qū)?yīng)編碼序列則跨越了由1個內(nèi)顯子隔開的兩個外顯子（圖3-B）。HvTIFYs基因不僅內(nèi)含子數(shù)量不同，而且內(nèi)含子長度也有明顯差異，導(dǎo)致這些基因的長度（1224～6245 bp）存在明顯差異（圖3-B和表1），比如HvTIFY15和HvTIFY2基因是2個最長的基因，其內(nèi)含子的長度至少占基因總長度的70%以上。

2. 3 大麥TIFY蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

保守基序分析結(jié)果（圖4）顯示，15個HvTIFYs蛋白中共鑒定出8個motif，且所有大麥TIFYs蛋白均含有motif 1和motif 2，其中motif 2含有TIFY結(jié)構(gòu)域的核心基序（圖5-A），motif 1則是缺少了末端保守的脯氨酸（P）和酪氨酸（Y）的Jas結(jié)構(gòu)域（圖5-B）。HvTIFY3、HvTIFY4、HvTIFY10和HvTIFY15還包含1個CCT結(jié)構(gòu)域（motif 4）（圖4和圖5-C）和1個GATA鋅指結(jié)構(gòu)域（motif 3）（圖4和圖5-D）。根據(jù)所含保守結(jié)構(gòu)域的不同，15個大麥TIFYs蛋白被分為ZML和JAZ亞族（表1），其中11個屬于JAZ亞族，4個屬于ZML亞族。

2. 4 大麥TIFY家族基因啟動子順式作用元件分析結(jié)果

啟動子區(qū)域是起始密碼子上游的一段DNA序列，包含多種順式作用元件，可調(diào)控植物對外源激素和環(huán)境脅迫的響應(yīng)（Wang et al.，2020）。為了探索HvTIFYs基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式及潛在功能，本研究利用PlantCARE對起始密碼子（ATG）上游2000 bp序列進行順式作用元件分析，結(jié)果顯示，15個HvTIFYs基因啟動子區(qū)域的順式作用元件種類及分布呈多樣性，至少含有2種以上順式作用元件（圖6），暗示HvTIFYs基因可能參與多種信號通路的調(diào)控，從而對環(huán)境脅迫作出應(yīng)答。將鑒定出的順式作用元件分為六大類：蛋白結(jié)合位點、調(diào)控元件、光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、生長發(fā)育相關(guān)元件和脅迫響應(yīng)元件（表3和圖6），其中，激素響應(yīng)元件和脅迫響應(yīng)元件數(shù)量最多，均為114個，故推測HvTIFYs基因在大麥的激素調(diào)控和逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。此外，15個HvTIFYs基因啟動子區(qū)域至少含有1個光響應(yīng)元件，表明HvTIFYs基因的轉(zhuǎn)錄可能受光周期調(diào)控。

2. 5 進化分析和共線性分析結(jié)果

為深入了解不同TIFY蛋白間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將擬南芥、野生大豆、水稻、二穗短柄草和大麥的TIFY蛋白序列（共79條）進行多序列比對，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果如圖7所示。將這5個物種的79條TIFY蛋白可分為4個組，恰好與TIFY家族的4個亞族對應(yīng)，其中，ZML、TIFY和JAZ亞族包含單、雙子葉植物的TIFY蛋白，而PPD亞族僅含有雙子葉植物的TIFY蛋白，不僅暗示TIFY基因在單、雙子葉植物分化前已存在，還暗示該家族的ZML、TIFY和JAZ亞族可能在單、雙子葉分化前就已存在。JAZ亞族成員數(shù)目最多，共56個TIFY蛋白可進一步分為3種類型：JAZ-Ⅰ（同時含單、雙子葉植物的TIFY蛋白）、JAZ-Ⅱ（只含單子葉植物的TIFY蛋白）和JAZ-Ⅲ（僅含雙子葉植物的TIFY蛋白），故推測JAZ-Ⅰ在單、雙子葉分化之前就已存在;JAZ-Ⅱ和JAZ-Ⅲ則出現(xiàn)在單、雙子葉分化之后分別在單、雙子葉植物內(nèi)單獨進化。大麥和二穗短柄草的TIFY蛋白通常分布在相鄰分支上，表明這兩個物種的親緣關(guān)系相對較近。15個HvTIFYs蛋白僅歸屬于ZML和JAZ兩個亞族，與上述TIFY、Jas、CCT和GATA保守域的氨基酸序列比對結(jié)果一致，進一步驗證本研究對大麥TIFY家族分類的可靠性。

共線性分析結(jié)果顯示，在大麥和擬南芥基因組間雖然存在共線區(qū)塊，但不存在共線性TIFY基因?qū)Γ▓D8-A）;在大麥和水稻基因組間存在4對共線性TIFY基因?qū)Γ℉vTIFY10與OsZML1、HvTIFY10與OsZML4、HvTIFY9與OsJAZ8、HvTIFY6與OsJAZ9）（圖8-B），其中HvTIFY10與水稻中的2個基因（OsZML1和OsZML4）均存在共線性，表明大麥與水稻的親緣關(guān)系比與擬南芥更近，與系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果一致。此外，大麥與水稻之間的這4對共線性TIFY基因在經(jīng)歷了物種分化等漫長的進化過程后仍維持了高度的保守，且具有相同或高度相似的功能，可根據(jù)水稻TIFY基因的功能來推測HvTIFYs基因的功能。

2. 6 大麥TIFY基因家族成員表達分析結(jié)果

基于Expression Atlas數(shù)據(jù)庫中的大麥RNA-Seq表達數(shù)據(jù)（E-MTAB-2809），本研究對大麥HvTIFYs基因在8個不同組織或發(fā)育階段的表達模式進行分析，結(jié)果圖9所示。15個HvTIFYs基因在不同組織器官中的表達量存在明顯差異，具有組織特異性。其中，HvTIFY1、HvTIFY2和HvTIFY8基因在8個組織中的表達量均較高，暗示這3個基因在8個組織的生長發(fā)育中起著重要作用;HvTIFY10和HvTIFY15基因在8個組織中的表達量中等;HvTIFY6基因在8個組織中的表達量均較低;HvTIFY11基因則在8個組織中均不表達。值得注意的是，3個高表達的基因（HvTIFY1、HvTIFY2和HvTIFY8）均屬于JAZ亞族，而2個表達量中等的基因（HvTIFY10和HvTIFY15）則均屬于ZML亞族。另外，還發(fā)現(xiàn)HvTIFY1、HvTIFY8和HvTIFY12基因在花序中的表達量隨著花序的發(fā)育而降低，而HvTIFY10和HvTIFY15正好相反。HvTIFY9基因在穎果中的表達量隨著穎果的發(fā)育而升高，而HvTIFY5、HvTIFY8和HvTIFY13基因則正好相反。可見，HvTIFYs基因在表達上具有時空特異性，暗示HvTIFYs基因在長期進化過程中發(fā)生了功能分化。

為了探究大麥在鹽脅迫誘導(dǎo)下HvTIFYs基因的表達差異，利用Expression Atlas數(shù)據(jù)庫下載的RNA-Seq表達數(shù)據(jù)（E-MTAB-4634）進行基因差異表達分析，結(jié)果如圖10所示。15個基因在根的不同組織中對鹽脅迫的敏感程度不同。例如，經(jīng)鹽脅迫誘導(dǎo)后，HvTIFY9基因的表達量在根尖上調(diào)，而在根分生區(qū)和根伸長區(qū)下調(diào)，尤其是在根的分生區(qū)的表達量減少50%;HvTIFY5基因雖然在根的3個組織中表達量均上調(diào)，但上調(diào)程度不同，尤其是在根尖中的表達量上調(diào)至1.62倍;HvTIFY6、HvTIFY12、HvTIFY13和HvTIFY14基因在根伸長區(qū)表達量上調(diào)，而在其他2個組織則無變化，特別是HvTIFY12基因在根伸長區(qū)中的表達量上調(diào)至1.52倍。HvTIFY11基因在根3個組織中不表達，經(jīng)鹽脅迫后仍無任何變化。

3 討論

TIFY家族作為一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育及脅迫防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。據(jù)Bai等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)二倍體植物中的TIFY基因家族成員通常為10～34個。本研究從大麥中鑒定出15個TIFY基因家族成員，在上述范圍內(nèi)。Zhao等（2016）從亞洲棉（二倍體）、雷蒙德氏棉（二倍體）和陸地棉（四倍體）中分別鑒定出21、28和50個TIFY基因家族成員。Xie等（2019）從烏拉爾圖小麥（二倍體，AA）、粗山羊草（二倍體，DD）和普通小麥（六倍體，AABBDD）中分別鑒定出13、17和63個TIFY基因。趙曉曉等（2019）從四倍體柳枝稷中鑒定出48個TIFY成員。由此可見，植物中TIFY基因家族成員數(shù)可能與基因組倍數(shù)有關(guān)。

在植物進化過程中，基因復(fù)制是基因家族擴張的主要途徑之一，有助于增加植物對環(huán)境的適應(yīng)能力，同時基因冗余也使基因功能的分化成為可能（Moore and Purugganan，2005）。基因復(fù)制分為兩種模式：全基因組重復(fù)和單基因重復(fù)（基因的串聯(lián)重復(fù)與片段重復(fù)）。本研究發(fā)現(xiàn)，HvTIFYs基因通常在染色體上成簇分布，形成了多個基因簇，這與大麥SBP基因家族在染色體上成簇分布的特征非常相似（蔡倩等，2019）。其中，位于7H染色體上的1個基因簇包括HvTIFY12、HvTIFY13和HvTIFY14基因，三者彼此相鄰，緊密排列，而且序列高度相似，進化關(guān)系非常近，屬于串聯(lián)重復(fù)基因，其編碼蛋白理化性質(zhì)、保守域、基因結(jié)構(gòu)及表達模式等方面雖高度相似但稍有不同，暗示這些串聯(lián)重復(fù)基因在進化中發(fā)生了亞功能化，共同行使祖先基因的功能。另外，HvTIFY12、HvTIFY13和HvTIFY14位于系統(tǒng)發(fā)育樹的一個獨立分支中，該分支內(nèi)無其他物種的TIFY基因，故推測三者是在大麥中單獨進化而來。相比之下，其他成簇分布的基因（如HvTIFY8和HvTIFY9）雖然在染色體上彼此相鄰，但在系統(tǒng)發(fā)育進化樹上分別處于不同的分支，而且各分支上均含其他物種（擬南芥、野生大豆、水稻和二穗短柄草）的基因，暗示HvTIFY8和HvTIFY9基因在單、雙子葉植物分化之前已存在了。

TIFY基因家族分為TIFY、PPD、JAZ和ZML 4個亞族（White，2006;Chini et al.，2007;Yan et al.，2007;Cai et al.，2014;Tian et al.，2019）。本研究系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果顯示，這4個亞族所包含的TIFY基因數(shù)目差別很大，其中，JAZ（56個）和ZML（17個）亞族成員數(shù)目最多，PPD（3個）和TIFY（3個）亞族成員較少，且PPD亞族分支中只含雙子葉植物（擬南芥和野生大豆）的3個TIFY基因。前人研究認為，PPD亞族可能在維管束植物分化后出現(xiàn)，隨后在單子葉植物譜系中消失，因此單子葉植物中不包含PPD亞族的TIFY基因（白有煌，2014），而TIFY亞族成員在進化過程中或許因基因復(fù)制等原因，獲得了其他結(jié)構(gòu)域（如GATA、CCT、PPD和Jas），進而演變成了JAZ或ZML亞族成員從而導(dǎo)致了TIFY亞族成員減少，而JAZ和ZML亞族成員增多。

TIFY保守域是TIFY家族的核心特征結(jié)構(gòu)域，該保守域的核心基序通常由6個氨基酸組成。目前，該保守基序主要有9種類型：TIFYXG、TII[F/Y]XG、TIS[F/Y]XG、TLF[F/Y]XG、TLL[F/Y]XG、TLS[F/Y]XG、TLV[F/Y]XG、TMF[F/Y]XG和VIF[F/Y]XG，其中TIFYXG為最主要的核心基序，其他幾種類型均是該基序內(nèi)個別氨基酸發(fā)生變化產(chǎn)生的（Bai et al.，2011）。本研究發(fā)現(xiàn)，15個HvTIFYs蛋白僅含有其中的4種核心基序：TIFYXG、TLLFXG、TLSFXG和TMFYXG，且67% HvTIFYs蛋白的TIFY保守域核心基序是TIFYXG，27%的核心基序為TL[L/S]FQG。值得注意的是，所有HvTIFYs蛋白的TIFY保守域核心基序中首尾2個氨基酸（T和G）完全保守，說明大麥TIFY家族蛋白核心基序的保守性相對更高。

本研究發(fā)現(xiàn)，HvTIFYs基因的表達存在組織特異性，而且對鹽脅迫的敏感程度也不相同，說明HvTIFYs基因存在一定的功能分化。15個大麥HvTIFYs基因上游啟動區(qū)鑒定出的順式作用元件種類和個數(shù)均不相同，推測其是導(dǎo)致HvTIFYs基因之間存在功能差異的主要原因（Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki，2005）。此外，15個大麥HvTIFYs基因均含有3～11個脅迫響應(yīng)元件，主要包括低溫脅迫、干旱脅迫、厭氧脅迫和缺氧脅迫等4種脅迫響應(yīng)類型，推測HvTIFYs基因參與這些逆境脅迫的響應(yīng)。HvTIFYs基因啟動子區(qū)中的干旱脅迫響應(yīng)元件數(shù)量最多，占脅迫響應(yīng)元件的50%以上，暗示HvTIFYs基因在抵御干旱脅迫中發(fā)揮重要調(diào)控作用。目前有關(guān)TIFY基因在干旱脅迫中的調(diào)控作用已在棉花（Zhao et al.，2016）、柳枝稷（趙曉曉，2019）、西瓜（Yang et al.，2019）和小麥（Xie et al.，2019）等多種植物中得到證實。此外，HvTIFYs基因啟動子區(qū)均含有茉莉酸相關(guān)元件，占激素相關(guān)元件的41%，與Chung和Howe（2009）報道的TIFY基因在茉莉酸信號傳遞中發(fā)揮重要調(diào)控作用相吻合。茉莉酸信號是生物脅迫與非生物脅迫反應(yīng)的“中央控制器”，可激活與植物生長、發(fā)育和防御相關(guān)基因的表達，尤其在植物響應(yīng)生物與非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，在植物的防御過程中起調(diào)控全局的作用（Ismail et al.，2012）。由此可見，大麥TIFY基因家族成員可能在大麥逆境脅迫防御反應(yīng)及激素信號調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

從大麥中鑒定出的15個HvTIFYs基因存在一定的功能分化，具有明顯的組織和時空特異性，推測其在大麥逆境響應(yīng)和激素調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

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（責任編輯 陳 燕）