柳春霞，時(shí)鵬飛，劉建國(guó)

［齊魯制藥（內(nèi)蒙古）有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010080］

1 概況

1.1 稀土概況

稀土離子又被稱為稀土元素，是典型的金屬元素，高純度的單一稀土金屬[1]。

1.2 稀土對(duì)微生物的影響

查詢資料表明[2-4]，一定濃度的稀土元素對(duì)微生物初期的生長(zhǎng)具有輕微的刺激作用，但隨著周期增長(zhǎng)，影響逐漸減小。

SchlyerB.D等[5]研究發(fā)現(xiàn)，稀土可將能量直接傳送給大腸桿菌堿性磷酸酶，促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，稀土刺激細(xì)菌生長(zhǎng)的主要作用機(jī)理可能是在細(xì)胞內(nèi)對(duì)某種作用的酶起激活劑作用。

1.3 胰蛋白酶

胰蛋白酶是動(dòng)物胰臟的主要蛋白酶，為白色或米黃色結(jié)晶性粉末，分子量約為24 000，溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚，酶作用的最適pH因底物而不同，一般多在7～9[6]，pH 5易自溶失活，pH＞9.0不可逆失活。Ca2+對(duì)酶活性有穩(wěn)定作用。

2 稀土Nd3+對(duì)胰蛋白酶的影響

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

試劑試液：

A：酶液；B：0.1mol/L、pH 8.0硼酸鹽緩沖液；C：10mg/mL酪蛋白溶液；D：5%三氯乙酸；E：0.2mol/L鹽酸溶液。

取21支試管分別編號(hào)為0-9管；10-20管；對(duì)照管。

取試管0-9，加入1.0mLA，再加入2.0mLB，在水浴保溫10min，精確加入40℃預(yù)熱的5.0mLC，混勻，立即置于40℃水浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)30min后，加入5.0（ml）D，迅速搖勻；

取第10-20號(hào)試管，加入1.0mLA，再加入2.0mLB，在水浴（40℃）保溫10min，精確加入5.0mLD，搖勻，在40℃水浴保溫30min后，再加5.0mlC，混勻。

取對(duì)照試管，分別加入5.0mlD和8.0mlA，混合。

將處理好的21支試管進(jìn)行離心（3 500r/min）處理10min，并取上清液待用。

將對(duì)照試管的上清液作為對(duì)照，測(cè)定0～20號(hào)試管上清液在275nm處的光吸收值。

酪氨酸（Tyr）對(duì)照液以E作為對(duì)照，在275nm處測(cè)定吸收值（AS）。

2.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.2.1 活力測(cè)定

胰蛋白酶活力單位：

其中式（1）中，A：試管1的吸光值；

A0：試管2的吸光值；

As：酪氨酸對(duì)照液的吸光值；

C對(duì)照：Tyr濃度（μg/mL）；

M對(duì)照：181.19（Tyr分子量）；

V總：總體積，mL；

V樣：加入的樣液體積，mL；

t：反應(yīng)時(shí)間，min；

n：樣品的稀釋倍數(shù)。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

（1）稀土離子濃度：1-8號(hào)管10-1～10-8g/mol，9號(hào)管，沒(méi)有加稀土離子 0號(hào)管稀土離子濃度為1g/mol，酶液濃度為 2×10-5g/mol

由圖1所示，可知稀土Nd對(duì)胰蛋白酶活性有一定的抑制作用。在10-2g/mol處，受到的抑制最小。

圖1 Nd對(duì)胰蛋白酶活性的影響

（2）稀土離子濃度：1-8號(hào)管10-1～10-8g/mol

9號(hào)管，沒(méi)有加稀土離子 0號(hào)管稀土離子濃度為1g/mol

濃度由原來(lái)的2×10-5g/mol變?yōu)闈舛葹?×10-4的酶液，以判斷稀土釹對(duì)胰蛋白酶的影響。且稀土離子增加了一組濃度為1g/mol的樣，來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

如圖2所示，酶濃度為2×10-4g/mol在稀土釹離子的作用下，幾乎均對(duì)胰蛋白酶有促進(jìn)的作用，其中在稀土離子的濃度為10-2g/mol 時(shí)，胰蛋白酶的活性最大，大約提高了28.4%的酶活力。在稀土離子的濃度為10-8g/mol時(shí)，亦為酶活性增加的一個(gè)極點(diǎn)。

圖2 Nd對(duì)胰蛋白酶活性的影響

（3）稀土離子濃度：稀土離子濃度：1-8號(hào)管10-1～10-8g/mol，9號(hào)管，沒(méi)有加稀土離子 0號(hào)管稀土離子濃度為1g/mol，酶液濃度為 2×10-5g/mol

在這次實(shí)驗(yàn)中，如圖3所示，酶濃度為2×10-5g/mol在稀土釹離子的作用下，幾乎均對(duì)胰蛋白酶有抑制的作用，其中在稀土離子的濃度為10-7g/mol 時(shí)，胰蛋白酶的活性最大，大約降低了68.63%的酶活力。在稀土離子的濃度為10-6g/mol時(shí)，胰蛋白酶的活性值在所有加入稀土釹離子胰蛋白酶溶液中最大。

圖3 Nd對(duì)胰蛋白酶活性的影響

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

由以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)論一致，即為稀土釹離子對(duì)于胰蛋白酶的活性有抑制的作用，使胰蛋白酶的活性降低。

3 紫外光譜分析

3.1 計(jì)算公式

摩爾消光系數(shù)ε與吸收度A的關(guān)系如下：

其中式（2）中C為所測(cè)樣品濃度，L為樣品池的厚度，A為吸收度。對(duì)已知樣品的ε，在一定L下，測(cè)得樣品溶液的A，即可求濃度C。

3.2 實(shí)驗(yàn)藥品

胰蛋白酶、硼砂（Na2B4O7·10H2O）、硼酸（H3BO3）、氯化鈉、氯化釹溶液：濃度：1mol/L，10-1～10-8mol/L、0.1mol/L的氯化鈣溶液[取氯化鈣5.549g，加水500mL 使之溶解，用0.1mol/L 鹽酸滴定液或氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）調(diào)節(jié) pH 至6.0～6.2]。

3.3 實(shí)驗(yàn)方法

3.3.1 時(shí)間對(duì)稀土釹離子與胰蛋白酶相互作用的影響

在8mL胰蛋白酶溶液（濃度為1×10-4mol/L）中加入40μL的稀土釹離子溶液，（濃度為1.0×10-2mol/L），混勻，室溫條件下反應(yīng)10、20、30、60、90、120min，緩沖液為空白對(duì)照，測(cè)定溶液的紫外吸收。

3.3.2 不同濃度的稀土釹離子對(duì)胰蛋白酶的影響

按照稀土釹離子與胰蛋白酶的摩爾比[Nd3+]/[Try]=0∶1，0.2∶1，0.5∶1，1∶1，2∶1，4∶1的比例，將稀土釹離子溶液（1×10-2mol/L）分次加入3.0mL的胰蛋白酶溶液（濃度為1×10-4mol/L）中，搖勻，室溫條件下反應(yīng)15min，緩沖液為空白對(duì)照，測(cè)定溶液的紫外吸收。

硼酸鹽緩沖液的配制：取硼砂2.85g、硼酸10.5g 與氯化鈉2.50g，加水使溶解成1 000mL，調(diào)節(jié)pH至7.5 ±0.1

3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4.1 時(shí)間因素對(duì)稀土釹離子與胰蛋白酶的相互作用的影響結(jié)果

稀土釹離子濃度為1.0×10-2mol/L，胰蛋白酶液濃度為1×10-4mol/L，OD值為275nm處的紫外吸收值。

3.4.2 相同時(shí)間下不同濃度的離子對(duì)胰蛋白酶的數(shù)據(jù)不同濃度稀土釹離子在相同時(shí)間處理后胰蛋白酶的紫外吸收光譜見(jiàn)圖5。

圖5 不同濃度稀土釹離子在相同時(shí)間處理后胰蛋白酶的紫外吸收光譜

3.4.3 結(jié)果與討論

從圖4～圖5中可知稀土離子與胰蛋白酶作用的時(shí)間不同，對(duì)胰蛋白酶體系紫外吸收差譜未產(chǎn)生明顯的影響，說(shuō)明稀土離子與胰蛋白酶在較短時(shí)間可能達(dá)到一個(gè)平衡，摩爾吸收系數(shù)相對(duì)穩(wěn)定。

圖4 稀土釹離子處理不同時(shí)間后胰蛋白酶的紫外吸收差譜

4 結(jié)論

以酪蛋白作為底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究稀土釹離子對(duì)胰蛋白酶活性的影響。并應(yīng)用紫外光譜分析稀土對(duì)胰蛋白酶結(jié)構(gòu)的影響。依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出以下結(jié)論：

1）在胰蛋白酶濃度確定及反應(yīng)時(shí)間一定的條件下測(cè)定稀土離子Nd3+對(duì)胰蛋白酶活性的影響，得出稀土離子Nd3+對(duì)胰蛋白酶活性影響為抑制作用。

2）稀土釹離子濃度的逐步增加，胰蛋白酶在220nm附近的吸收峰也升高，并出現(xiàn)了輕微的紅移現(xiàn)象，可能是稀土釹離子影響了胰蛋白酶，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化，造成了胰蛋白酶吸收系數(shù)的改變。