王耀坤，聶姍姍，邱梓峰，陳 穎，徐 蘭，杜云婷

(1.佳木斯大學醫(yī)學部，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；3.中國醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院，遼寧省腫瘤醫(yī)院檢驗科，遼寧 沈陽 110042)

乳腺癌仍然是影響女性健康的最主要的惡性腫瘤之一，每年死亡的女性約占458,000人[1]。多年以來，乳腺癌在經(jīng)濟發(fā)達國家的發(fā)病率一直居高不下。有報道指出乳腺癌可能超過宮頸癌成為發(fā)展中國家婦女與癌癥相關(guān)的主要死亡原因[2]。因此，迫切需要更有效的治療方案來治療和控制乳腺癌。截至目前，乳腺癌的治療手段包括放射治療，靶向治療，化學治療和內(nèi)分泌治療。對于是否成功防止治療后復發(fā)主要取決于機體的免疫應(yīng)答的及時性和效應(yīng)性。因此，臨床上任然需要探究有效的治療方。L-arg是成年人的有條件必需氨基酸，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，研究表明使用L-arg促進乳腺癌細胞死亡[3]。細胞程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)是一種T淋巴細胞表面受體，負性調(diào)節(jié)T細胞抗原受體信號，抑制免疫系統(tǒng)和T細胞炎癥反應(yīng)，促進自身免疫耐受[4]。有研究指出，免疫治療對乳腺癌患者有積極作用[5]。

本研究旨在確定L-arg和PD-1抑制劑聯(lián)合療法對乳腺癌患者免疫應(yīng)答及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和4T1荷瘤小鼠模型構(gòu)建

6～8周齡雌性BALB/c小鼠，給予適宜溫度和標準飼料喂養(yǎng)，4T1細胞在37°C的含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中和含有5%CO2的培養(yǎng)箱中生長。將2×105個4T1乳腺癌細胞懸液經(jīng)皮下注射到每只小鼠的腹側(cè)，建立了4T1荷瘤小鼠模型，根據(jù)小鼠腫瘤體積的測量公式(0.5×長×寬2)于成瘤后第7～10天測腫瘤體積在150～200mm3間，進而確定造模成功。

1.2 主要儀器和試劑

4T1乳腺癌細胞系購自中國科學院上海細胞庫，L-arg和膠原酶IV購自美國Sigma公司，PD-1抑制劑(clone 29F.1A12)和對照組的IgG單抗(clone 2A3)購自美國 Bioxcell 公司，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗小鼠CD4(anti-CD4-FITC)、藻紅蛋白(PE)標記的抗小鼠CD11b單克隆抗體(anti-CD11b-PE)、多甲藻葉綠素(PerCP)標記的抗小鼠CD8單克隆抗體(anti-CD8-PerCP)，別藻藍蛋白(APC)標記的抗小鼠Gr-1單克隆抗體(anti-Gr-1-APC)購自美國BD Biosciences公司。

1.3 4T1荷瘤小鼠分組及治療

32只BALB/c隨機分為4組，每組8只：4T1荷瘤組(PBS組)，荷瘤后治療組(L-arg組、anti-PD-1組、L-arg + anti-PD-1組)。于成瘤后第10天(150～200mm3)開始治療。L-arg組小鼠灌胃L-arg[1.5g/(kg·d)，連續(xù)20d][6]；PD-1抑制劑組小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射anti-PD-1[250μg/只，于成瘤后第10,14,18天治療][7]；PBS組在相同的時間點以等體積的PBS和IgG單克隆抗體治療。

1.4 流式細胞術(shù)分析脾臟和細胞

荷瘤后第30天每組各處死3只小鼠，脾臟在無菌條件環(huán)境取下并通過200目無菌不銹鋼濾網(wǎng)研磨，每個脾臟用10mL 10%胎牛血清溶液(fetal calf serum，F(xiàn)CS)，25mmol/L HEPES緩沖液，0.12%慶大霉素和2mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基制成細胞懸液。室溫調(diào)至離心機350×g離心10min 后，用冰的紅細胞裂解液裂解紅細胞，RPMI 1640反復洗滌2次，用含10% FCS的RPMI 1640 將每個脾細胞終濃度調(diào)整至1×107個/mL，加入流式細胞管1×106個/(管·100μL)。進行anti-CD4-FITC和anti-CD8-PE進行表面染色，4 ℃避光孵育30 min，BD流式細胞儀上機檢測并計數(shù)。用Flowjo v7.6.2 6.1軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 流式細胞術(shù)分析腫瘤組織MDSCs(CD11b+Gr-1+)數(shù)量

荷瘤后第30天每組各處死3只小鼠，腫瘤組織取出后切成小塊，用500U/mL膠原酶IV型在37°C溫箱攪拌下消化1h。使所得細胞通過200目無菌不銹鋼濾網(wǎng)研磨并用PBS緩沖液洗滌活細胞。用含10% FCS的RPMI 1640將每個腫瘤細胞終濃度調(diào)整至1×107個/mL，加入流式細胞管1×106個/(管·100μL)。進行anti-CD11b-FITC和anti-Gr-1-PE進行表面染色，4 ℃避光孵育30min，BD流式細胞儀計數(shù)。用Flowjo v7.6.2 6.1軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.6 實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)分析腫瘤組織IFN-γ和Treg相對表達量

小鼠處死后取出腫瘤組織，將100mg組織放于1mL TRizol中，組織勻漿后加入0.2mL氯仿將反復混合，4℃下12,000×g離心20min，將水層轉(zhuǎn)移到新Ep管中。用0.5mL異丙醇0.5mL上下顛倒混勻后靜置10min，4℃下12,000×g離心10min。緩慢倒掉上清，輕輕的沿離心管壁加入lmL 75%的乙醇，渦旋震蕩，12,000g 4℃離心5 min后小心棄去乙醇。室溫干燥沉淀5min左右，25μL RNase-free溶解沉淀，56℃ 10min 水浴后進行 RNA定量，于-80℃保存。總RNA用寡聚(dT)引物進行逆轉(zhuǎn)錄。將得到的cDNA樣品用于進行qRT-PCR測定，SYBR Green PCR試劑盒用于測定IFN-γ和TNF-α。此處使用的引物序列見表1。PCR在ABI PRISM 7500裝置上進行40個循環(huán)。計算閾值并使用PE Biosystem軟件量化mRNA。β-actin是用作內(nèi)參來確定每個目標基因的相對比例。通過熔解曲線分析PCR數(shù)值。引物序列：β-actin：上游引物5’-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3’，下游引物5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3’。IFN-γ：上游引物5’-GTTACTGCCACGGCACAGTCATTG-3’，下游引物5’-ACCATCCTTTTGCCAGTTCCTCCAG-3’。TNF-α：上游引物5’-GCAAGCTTCGCTCTTCTGTCTACTGAACTTCGG-3’，下游引物5’-GCTCTAGAATGAGATAGCAAATCGGCTGACGG-3’。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析，采用獨立樣本t檢驗分析各組小鼠血腦屏障通透性及流式細胞數(shù)據(jù)。檢驗水準為α=0.05。

1.8 倫理批準和患者知情同意

本研究的動物實驗使用遵循實驗動物相關(guān)規(guī)范，不涉及患者知情同意。

2 結(jié)果

2.1 不同組別小鼠的腫瘤大小，生存期，及腫瘤重量比較

荷瘤后第28-56天，PBS組腫瘤體積顯著高于L-arg + anti-PD-1組(P<0.05)。PBS組小鼠PBS組小鼠死亡發(fā)生在荷瘤后第13天至第56天；L-arg組、anti-PD-1組、L-arg + anti-PD-1組死亡均發(fā)生于荷瘤后第16，28和53天；同時，荷瘤后第70天，PBS組與L-arg組小鼠全部死亡，而anti-PD-1組、L-arg + anti-PD-1組各有25%和43%的小鼠存活。見圖1。

圖1 4T1荷瘤小鼠經(jīng)L-arg、anti-PD-1治療后的腫瘤體積，生存期，腫瘤重量分析

2.2 脾臟中和細胞的流式細胞術(shù)結(jié)果

圖2 4T1荷瘤小鼠經(jīng)L-arg、anti-PD-1治療后的脾臟中和細胞的百分比、絕對數(shù)和散點圖

2.3 腫瘤中MDSCs細胞的流式細胞術(shù)結(jié)果

流式細胞術(shù)檢測小鼠荷瘤30d腫瘤組織中MDSCs細胞百分比和絕對數(shù)，結(jié)果顯示PBS組(28.91±3.00)%高于L-arg組(21.35±3.00)%(t=3.89，P< 0.05)和L-arg+anti-PD-1組(15.3±1.13)%(t=7.34，P<0.01)但與anti-PD-1組(22.08±4.50)%(t=2.18，P>0.05)無統(tǒng)計學意義。見圖3。

圖3 4T1荷瘤小鼠經(jīng)L-arg、anti-PD-1治療后的腫瘤組織中MDSCs細胞的百分比、絕對數(shù)和散點圖

2.4 腫瘤中IFN-γ和TNF-α相對表達量

實時定量PCR中檢測小鼠荷瘤30d腫瘤組織中IFN-γ和TNF-α的mRNA相對表達量，結(jié)果顯示PBS組(1.39±0.39)% IFN-γ的mRNA相對表達量均低于L-arg組(2.41±0.32)%(t=3.47，P<0.05)，anti-PD-1組(3.83±0.97)%(t=4.03，P<0.05)，L-arg+anti-PD-1組(6.08±0.50)(t=12.71，P<0.01)，PBS組(1.31±0.28)% 中TNF-α的mRNA相對表達量均低于L-arg組(5.08±0.55)%(t=9.43，P<0.01)，anti-PD-1組(7.16±1.02)%(t=9.57，P>0.01)，L-arg+anti-PD-1組(8.77±0.72)%(t=16.64，P<0.01)。見圖4。

圖4 4T1荷瘤小鼠腫瘤中IFN-γ和TNF-α mRNA的相對表達量

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