秦坤 徐紹業(yè) 韓雨 閆建國 夏春波 邵曉云

桂林醫(yī)學院1人體解剖學教研室，2科學實驗中心，3生理學教研室（廣西 桂林 541100）

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是中樞神經系統常見的進行性、變性性疾病，黑質多巴胺能（dopaminergic，DAG）神經元選擇性凋亡被認為是PD 的主要病理變化之一［1］。已有研究發(fā)現，DAG神經元軸突終末變性可能是導致PD 發(fā)生細胞凋亡的首要因素，而軸突嚴重變性時可能導致了細胞骨架蛋白——微管的功能異常［2-3］。

死亡相關蛋白激酶1（death-associated protein kinase，DAPK1）是一種編碼160 KDa蛋白的鈣離子/鈣調蛋白（Ca2+/CaM）依賴的絲氨酸/蘇氨酸激酶，廣泛表達于人、大鼠和小鼠的正常組織中，以腦組織和肺組織表達最強，在多種神經系統疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ?、中風等）的細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用［4］。DAPK1 作為腫瘤抑制因子，可正性調節(jié)細胞凋亡，在腫瘤細胞中表達減少，但其在神經退行性病變中則表達增多［5］。而且，DAPK1 還可以調節(jié)微管的合成、神經元分化以及微管相關蛋白Tau 的毒性［6］。目前，DAPK1 在PD 中的研究甚少。因此，本研究通過構建pLKO.1-shDAPK1 慢病毒敲減質粒，包裝病毒后感染并篩選穩(wěn)定低表達DAPK1的SH-SY5Y 細胞系，驗證DAPK1 在SH-SY5Y 細胞中的蛋白表達水平，并證明在SH-SY5Y 細胞中抑制DAPK1 對細胞凋亡的影響，為進一步研究DAPK1 在PD 中的發(fā)病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑慢病毒三質粒系統（載體質粒pLKO.1-TRC、輔助質粒psPAX2 和pMD2.G）及SH-SY5Y 細胞由西安空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院楊倩教授惠贈；HEK293T 細胞由我?？茖W實驗中心饋贈；shRNA-DAPK1 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；限制性內切酶EcoRⅠ和AgeⅠ、T4 DNA 連接酶購自NEB 公司；DH5α 感受態(tài)細胞購自生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA分子量Marker 購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自康為世紀生物科技股份有限公司；Lipo3000 轉染試劑購自美國賽默飛世爾公司；DMEM 培養(yǎng)基購自美國GIBCO 公司；FBS 標準級胎牛血清購自上海依科賽公司；嘌呤霉素購自翊圣生物科技（上海）有限公司；兔抗人DAPK1 多克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體均購自美國Proteintech 公司；鼠抗人Caspase-3 單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2 單克隆抗體和鼠抗人Bax 單克隆抗體購自Santa Cruz 公司；二抗購自北京中杉；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；FACSCanto流式細胞分析儀購自美國Beckman Coulte 公司。

1.2 方法

1.2.1 shRNA 干擾片段設計與合成根據Sigma公司網站Mission shRNA 模塊（https：//www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/semi-configurators/shrna?activeLink），獲得shRNA-DAPK1 靶標序列，參考shRNA 設計策略，以CTCGAG 為loop 環(huán)，并在引物兩端分別加入EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位點，最終設計shDAPK1 上游引物為5'-CCGGCCACGTCGATACCTTGAAATTCTCGAGAAGGTATCGACGTGGTTTTTG-3'，下游引物為5'-AATTCAAAAACCACGTCGATACCTTGAAATTCTCGAGAATTTCAAGGTATCGACGTGG-3'，由生工生物公司合成。將合成的引物稀釋為20 μmol/L，95 ℃水浴10 min，自然冷卻至室溫，-20 ℃儲存?zhèn)溆?，退火后的引物即為具有粘性末端的雙鏈shDNA 干擾片段。

1.2.2 質粒重組用核酸內切酶EcoRⅠ和AgeⅠ對pLKO.1慢病毒載體進行雙酶切，將適量的酶切產物與退火引物在T4 連接酶的作用下4 ℃過夜。次日，將連接產物用DH5α 感受態(tài)細胞中進行轉化、種板，挑取單克隆搖菌并提質粒后送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，最終確定重組慢病毒敲減質粒pLKO.1-shDAPK1構建正確與否。

1.2.3 病毒包裝取對數生長期HEK293T 細胞重懸接種，待細胞密度達80%～90%時，用Lipo3000轉染試劑將重組慢病毒pLKO.1-shDAPK1 敲減質粒（包括輔助質粒pMD2.G 和psPAX2）轉染至HEK293T 細胞中，以空載體pLKO.1-TRC 作為陰性對照（shNC）。轉染16 h 后換液，并于72 h 收集上清培養(yǎng)基，用0.45 μm 濾器過濾后獲得慢病毒溶液，分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 病毒感染及穩(wěn)轉細胞系篩選將SH-SY5Y細胞接種到培養(yǎng)皿中，待其匯合度約為40%～50%時，以半量換液方式換為pLKO.1-shDAPK1 或pLKO.1-shNC 慢病毒感染液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后更換為正常培養(yǎng)基，當細胞生長至平臺期時進行傳代，并應用加入5 μg/mL 嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進行篩選，設置未感染病毒的細胞為空白對照組（Control），經過4～6 次嘌呤霉素篩選傳代后，當未感染病毒的對照組細胞全部死亡，而感染了病毒的pLKO.1-shDAPK1 或pLKO.1-shNC 組的細胞大量存活，獲得敲減DAPK1 的穩(wěn)定感染細胞系shDAPK1-SY5Y 和陰性對照shNC-SY5Y，并對其進行擴增保種和后續(xù)鑒定。

1.2.5 Western blot 檢測DAPK1 敲減效率收集穩(wěn)定感染慢病毒pLKO.1-shDAPK1 或pLKO.1-shNC的SH-SY5Y 細胞總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，以40 μg 蛋白上樣量用10%聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白免疫印跡，應用兔抗人DAPK1 抗體（1∶1 000）Western blot 檢測shDAPK1-SY5Y 穩(wěn)轉細胞系中DAPK1 的蛋白表達情況。

1.2.6 檢測敲減DAPK1 對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響將pLKO.1-shDAPK1 慢病毒感染的SH-SY5Y 穩(wěn)轉細胞系培養(yǎng)至70%左右匯合時加入MPP+（200 μmol/L）作用24 h，同時設置空白對照組（Control），各組分別設置兩份，第一份收集細胞總蛋白，以40 μg 蛋白上樣量用12%聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白免疫印跡，應用鼠抗人Caspase-3單克隆抗體（1∶1 000）、鼠抗人Bcl-2 單克隆抗體（1∶1 000）和鼠抗人Bax 單克隆抗體（1∶1 000）Western blot 檢測經MPP+作用后細胞系中Caspase-3、Bcl-2 和Bax 的蛋白表達情況；第二份收集細胞，用1×PBS 重懸并計數，取5×105重懸的細胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC 結合液輕輕重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，最后加入10 μL 碘化丙啶（PI）染色液，輕輕混勻。室溫（20～25 ℃）避光孵育10～20 min，篩網過濾并移入流式上樣管，立即上機檢測，使用FlowJo 軟件進行數據分析。

1.3 統計學方法實驗所得數據以（±s）表示，實驗組和對照組蛋白表達水平采用非配對t檢驗進行組間差異性檢驗，使用GraphPad Prism 5 統計軟件分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒質粒pLKO.1-shDAPK1的構建及鑒定將慢病毒骨架質粒pLKO.1-TRC（全長8 901 bp），用EcoRⅠ和AgeⅠ雙酶切后得到7 026 bp 和1 875 bp兩個片段（圖1），回收酶切后的線性載體（7 026 bp）并將其與退火的目的干擾片段用T4 連接酶進行連接，單克隆后進行DNA 測序，測序結果顯示，重組慢病毒質粒pLKO.1-shDAPK1 的DNA 序列與所設計的干擾序列完全一致（圖2），表明慢病毒敲減質粒pLKO.1-shDAPK1 構建成功。

圖1 pLKO.1-TRC 空載質粒酶切產物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Enzyme digestion results of pLKO.1-TRC-vector

圖2 重組PLKO.1-shDAPK1 質粒DNA 測序及序列比對Fig.2 DNA sequencing and sequence alignment of recombinant PLKO.1-shDAPK1 plasmid

2.2 慢病毒包裝及穩(wěn)定干擾DAPK1基因的SH-SY5Y細胞系的建立將pLKO.1-shDAPK1（或pLKO.1-shNC）表達質粒與輔助質粒共轉染HEK293T 細胞，轉染72 h 后提取細胞總蛋白進行Western blot檢測轉染效率，結果顯示pLKO.1-shDAPK1（或pLKO.1-shNC）質粒被成功轉染并在HEK293T 細胞中表達（圖3）；同時將細胞培養(yǎng)上清病毒液感染SH-SY5Y 細胞，提取具有嘌呤霉素抗性的細胞總蛋白，Western blot 檢測結果顯示，在感染pLKO.1-shDAPK1 病毒的SH-SY5Y 細胞中DAPK1 蛋白的表達量明顯低于對照組（pLKO.1-shDAPK1&pLKO.1-shNC，P＜0.000 1；pLKO.1-shDAPK1 & control，P＜0.000 1）（圖4），表明感染pLKO.1-shDAPK1 慢病毒顆粒的SH-SY5Y 細胞穩(wěn)定敲減了DAPK1 基因。

圖3 DAPK1 在病毒包裝的HEK293T 細胞中的蛋白表達Fig.3 DAPK1 protein expression in HEK293T cells packaged shDAPK1 plasmid by lentivirus

圖4 慢病毒感染的SH-SY5Y 穩(wěn)轉細胞系中DAPK1 蛋白表達Fig.4 Expression of DAPK1 protein in SH-SY5Y stably transfected cell line infected

2.3 細胞凋亡相關蛋白在敲減DAPK1的SH-SY5Y穩(wěn)轉細胞系中的表達水平收集經MPP+處理的細胞并提取總蛋白，Western blot 檢測結果中，實驗組與空白對照組比較，經MPP+處理后Bax表達下降，Bcl-2表達上調，Bax/Bcl-2比值降低，Caspase-3活性下調，差異均有統計學意義（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，圖5）。提示敲減DAPK1 會抑制帕金森病細胞模型中Bax/Bcl-2 比值升高，Caspase-3 活性上調，從而抑制細胞凋亡的發(fā)生。

圖5 慢病毒感染的SH-SY5Y 穩(wěn)轉細胞系中細胞凋亡相關蛋白表達Fig.5 Expression of apoptosis related proteins in SH-SY5Y stable cell line infected with lentivirus

2.4 流式細胞術檢測抑制DAPK1 對細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測結果顯示，對照組（control-MPP+）SH-SY5Y 細胞出現明顯凋亡，而DAPK1 敲減組（shDAPK1-MPP+）的細胞凋亡發(fā)生率顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.000 1，圖6）。

圖6 流式細胞術檢測SH-SY5Y 細胞凋亡Fig.6 Apoptosis of SH-SY5Y cells was detected by flow cytometry

3 討論

PD 的主要特征是黑質DAG 神經元的進行性不可逆丟失，異常聚集的α-synuclein 蛋白是PD 的病理學標志物，其過表達可促進多種細胞系和動物模型中凋亡細胞的死亡。研究表明，α-synuclein參與了多種生物過程，包括神經退行性疾病的發(fā)病機制和腦功能異常等［7］；DAG 神經元凋亡是神經遞質變化、氧化應激、線粒體功能損傷、神經營養(yǎng)因子缺乏等多種因素共同作用的結果［8］。但當前對帕金森病的治療僅限于保護神經細胞，并不能減緩黑質DAG 神經細胞凋亡或退行性變，其主要原因可能是人們對造成神經細胞凋亡或退行性變的分子機制了解甚少。

蛋白激酶是催化末端磷酸基團從ATP 轉移到其他蛋白質的酶［9］。通過磷酸化某個蛋白質殘基（Tyr，酪氨酸激酶；Ser/Thr，Ser/Thr 激酶），激酶共價調節(jié)其他蛋白質的活性，最終控制人類細胞的幾乎所有方面，包括細胞增殖、發(fā)育和存活［10］。對人類基因組的分析揭示了迄今為止已知的518種激酶，以及幾種激酶突變體、脂質激酶和假激酶［11-12］。蛋白激酶家族可分為兩大亞組：蛋白酪氨酸激酶（PTKs）和STKs［13-14］。STKs 細分為六個主要亞組，包括cAMP 依賴性蛋白激酶/蛋白激酶G/蛋白激酶C 擴展家族（AGC）；鈣-鈣調蛋白依賴性激酶（CaMK）；CDK、MAPK、糖原合酶激酶和CDK 樣結構域（CMGC）；STE11 和STE20（STE）的同源物；酪蛋白激酶（CK）；和酪氨酸激酶樣（TKL）組［15-17］。

死亡相關蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）家族是STKs 家族中的重要家族之一，在人類細胞中調控多種生物學功能。DAPK 家族結構域包括DAPK1、DAPK2（又名DAPK 相關蛋白激酶1；DRP-1）和DAPK3（又名拉鏈相互作用蛋白激酶，也稱為DAP 樣激酶，Dlk），以及DRAK1和DRAK2（DAPK 相關凋亡誘導蛋白激酶1 和2，也分別稱為STK-17A 和B；STK17A 和B）［18-19］。DAPK1 是一種在神經元發(fā)育過程中高表達的促凋亡激酶，負責多種類型（包括凋亡和自噬）的細胞死亡，與許多神經系統疾病有關，如中風、抑郁癥和阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）等。DAPK1 是凋亡細胞死亡的正調控因子，在調節(jié)神經元細胞死亡中具有關鍵功能，可以調節(jié)多種神經元損傷模型中的細胞凋亡［4，20-22］。研究［23］表明，在成年大腦中，神經元死亡時，DAPK1 重新激活并被招募到突觸外NMDAR 復合物中，放大毒性受體功能。在PD 模型小鼠和PD 患者的研究中顯示，由于轉錄因子C/EBPα 降低而導致miR-26a 缺失，從而導致DAPK1 轉錄后表達升高，miR-26a 的缺失和DAPK1 的過表達都誘導了α-synuclein 的過度磷酸化、聚集和包含的形成，從而進一步導致DAG神經元的死亡和運動異常［24］。抑制DAPK1 已在中風、AD、PD 和慢性應激的動物模型中顯示出有益之處，其原因主要是抑制DAPK1 活性或表達可減輕中風小鼠模型中神經元細胞的死亡以及AD動物模型中與AD 相關的神經病理學，表明抑制DAPK1 可能保護神經元免受損傷［20-21，25］，提示DAPK1 可能是神經保護的新靶點。

為了進一步探討PD模型中抑制DAPK1對細胞凋亡的影響，應用慢病毒干擾技術在SH-SY5Y 細胞中敲減DAPK1。慢病毒載體是一種以人類免疫缺陷型病毒為基礎發(fā)展起來的逆轉錄病毒載體，其在分子以及細胞生物實驗中有著廣泛的應用，與其他逆轉錄病毒相比，可選擇的宿主具有多樣性，對分裂細胞和未分裂細胞均具有感染能力，能夠有效地將目的基因整合到宿主細胞中。同樣與傳統脂質體轉染法相比，慢病毒的轉染率更高，并能在載體中持續(xù)而穩(wěn)定的表達，在構建目的基因方面得到廣泛應用［26］。本研究選擇pLKO.1-TRC、psPAX2、pMD2.G 三質粒系統成功構建并包裝了pLKO.1-shDAPK1 慢病毒，Western blot 驗證了其感染SH-SY5Y 細胞后敲減DAPK1 的蛋白表達水平，經嘌呤霉素篩選后獲得了穩(wěn)定低表達DAPK1 的SH-SY5Y 細胞系；在應用MPP+誘導shDAPK1-SHSY5Y 細胞構建的PD 細胞模型中，Western blot 與流式細胞儀檢測結果均表明抑制DAPK1 可顯著降低細胞凋亡的發(fā)生率，這對后續(xù)進一步研究DAPK1在PD 發(fā)病過程中的作用奠定了重要的基礎。