周永新 翟文靜 賈志強(qiáng) 趙曉光 王磊 方麗萍 翟莎菲 黃濤

1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科（西安 710077）；2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院（西安 710004）；3河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院（河南 洛陽(yáng) 471099）；4西安市人民醫(yī)院（西安 710068）；5西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院（西安 710021）

脊髓損傷（SCI）是脊柱損傷最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致嚴(yán)重的肢體功能障礙［1］。然而，在SCI 的治療中仍缺乏有效的治療手段［2］。目前，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植技術(shù)被廣泛用于SCI治療［3-4］。近年來，大量研究提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，通過將治療性miRNA 轉(zhuǎn)移到產(chǎn)生外泌體的細(xì)胞，可以在培養(yǎng)物中制造外泌體。在已知產(chǎn)生外泌體的細(xì)胞類型中，MSCs 是最常見的，因此將含有治療性miRNA 的MSCs 用于治療SCI 可發(fā)揮更好的臨床療效［5］。脊髓損傷后會(huì)有多個(gè)miRNA的異常表達(dá)，而miR-210 的過表達(dá)可在SCI 大鼠中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［6］。miR-210-5p 屬于miR-210基因家族［7］，但關(guān)于miR-210-5p 在治療脊髓損傷中的作用尚未明確。因此，本研究通過觀察miR-210-5p 外泌體在SCI 大鼠的功能恢復(fù)中的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制，旨在為SCI 治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物成年雄性SD 大鼠（200±25 g）由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)為SCXK（陜）2020-001）。將所有動(dòng)物在光循環(huán)控制環(huán)境中飼養(yǎng)1 周，自由進(jìn)食進(jìn)水。所有動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并符合科技部的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用準(zhǔn)則》和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院批準(zhǔn)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》。

1.2 主要試劑DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000TM；山羊抗兔、兔抗鼠IgG；TRIzol 試劑；ExoQuick exosome提取試劑盒；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，miScript SYBR Green熒光定量PCR 試劑盒；RIPA 裂解緩沖液和BCA 蛋白測(cè)定試劑盒；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒。

1.3 儀器KZ-Ⅱ型勻漿儀；D3024R型臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)；Multiskan FC 型多功能酶標(biāo)分析儀；Real-time PCR儀；20486型顯微攝像儀；NikonDSU3 型成像系統(tǒng)。

1.4 方法

1.4.1 MSCs 取材、分離和培養(yǎng)從體質(zhì)量80～100 g 的雄性大鼠中分離股骨和脛骨的骨髓，PBS沖洗，收集沖洗液4 ℃，以1 000×g離心5 min，將沉淀物用PBS制成濃度為1×1010細(xì)胞/L的懸浮液，并將其接種于含15%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基中，然后在5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。每3 d更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)85%左右時(shí)，進(jìn)行消化和傳代。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理將60只SD大鼠按每組12只隨機(jī)分為假手術(shù)組、SCI 組、MSCs 組、MSCs-NC mimic 組和miR-210-5p 外泌體組。造模方法：基于LIU 等［8］方法用中度挫傷誘導(dǎo)SD 大鼠SCI 模型。造模成功后，每天尾靜脈注射200 μL 的MSCs 外泌體或NC mimic 外泌體或miR-210-5p 外泌體；假手術(shù)組和SCI 模型組每天尾靜脈注射200 μL 的生理鹽水溶液，連續(xù)7 d。建模成功2 周后，二氧化碳窒息處死所有SD 大鼠。

1.4.3 運(yùn)動(dòng)能力評(píng)估通過運(yùn)用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）運(yùn)動(dòng)評(píng)定量表，從0～21 評(píng)估后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)：0，無運(yùn)動(dòng)活動(dòng)；21，正常運(yùn)動(dòng)［9］。兩名對(duì)治療不知情的獨(dú)立研究人員在受傷前以及受傷后第5、9、14 天觀察了運(yùn)動(dòng)并對(duì)運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行了評(píng)分。

1.4.4 RT-qPCR 檢測(cè)根據(jù)制造商的說明，通過TRIzol 試劑提取來自MSCs、外泌體或脊髓組織中的總RNA。對(duì)于體內(nèi)研究，取一段長(zhǎng)10 mm 的脊髓，其中包含震中損傷的部位。將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用miScript SYBR Green 熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，經(jīng)2-ΔΔCT方法分析基因的相對(duì)表達(dá)。

1.4.5 Western blot利用RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白，BCA 蛋白測(cè)定試劑盒評(píng)估蛋白質(zhì)濃度，在12%的SDS-PAGE 上分離并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。用5%脫脂牛奶封閉后，將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜。與二抗在室溫下孵育1 h。利用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒使條帶可視化，并通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，Image J 軟件進(jìn)行量化帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有結(jié)果均為計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。運(yùn)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行，多組之間比較采用單因素方差分析進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少三次，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體促進(jìn)SCI 大鼠的功能恢復(fù)SCI 損傷后，BBB 評(píng)分約為0.1，提示成功構(gòu)建SCI 模型。5 d 后，觀察到miR-210-5p外泌體組比NC mimic 對(duì)照組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯著升高（第5 天，P＜0.05；第9 天，P＜0.001；第14 天，P＜0.01）。見表1。

表1 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體對(duì)SCI 大鼠BBB 評(píng)分的影響Tab.1 Effects of miR-210-5p modified MSCs derived exosomes on BBB scores in SCI rats ±s

表1 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體對(duì)SCI 大鼠BBB 評(píng)分的影響Tab.1 Effects of miR-210-5p modified MSCs derived exosomes on BBB scores in SCI rats ±s

注：與假手術(shù)組比較，1P＜0.05，2P＜0.01；與模型組比較，4P＜0.05，5P＜0.01；與MSCs 組比較，nsP＞0.05；與MSCs-NC mimic 組比較，3P＜0.01

組別/時(shí)間假手術(shù)組模型組MSCs組MSCs-NCmimic組miR-210-5p外泌體組建模后14±2.5 0.1±0.02 0.1±0.03 0.1±0.01 0.1±0.02 5 d 20±1.0 1±0.072 3±0.104 4±0.14ns 10±0.183 9 d 20±0.7 2±0.102 5±0.124 6±0.09ns 14±0.353 14 d 20±0.9 2±0.052 7±0.155 8±0.21ns 16±0.433

2.2 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體促進(jìn)SCI 大鼠Nrf2 的表達(dá)與SCI 模型組相比，用miR-210-5p外泌體注射SCI 大鼠，顯著增加了大鼠脊髓組織中GAP-43和NF的蛋白表達(dá)（P＜0.01）。SCI后的大鼠脊髓組織中Nrf2 蛋白水平顯著降低（P＜0.01），注射miR-210-5p外泌體后SCI大鼠的Nrf2蛋白表達(dá)水平升高，恢復(fù)到正常表達(dá)水平（P＞0.05）。見圖1。

圖1 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體促進(jìn)SCI 大鼠軸突生長(zhǎng)和Nrf2 的表達(dá)Fig.1 Injection of miR-210-5p modified MSCs derived exosomes promoted axonal outgrowth and Nrf2 expression in SCI rats

2.3 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體通過Keap1-Nrf-2 信號(hào)通路促進(jìn)SCI 大鼠的HO-1、NQO1 表達(dá)與假手術(shù)組大鼠相比，SCI 組脊髓組織中的Keap1 表達(dá)顯著上調(diào)，Nrf-2、血紅素加氧酶1（HO-1）、醌氧化還原酶（NQO1）的mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；miR-210-5p 分泌體注射SCI 大鼠后脊髓組織中Keap1 的表達(dá)顯著降低，Nrf-2、HO-1、NQO1 的表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。見表2、圖2。

圖2 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體激活SCI 大鼠的Keap1-Nrf-2 信號(hào)通路Fig.2 Injection of miR-210-5p modified MSCs derived exosomes promoted the expression of HO-1，NQO1 and GCLC in SCI rats

表2 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體促進(jìn)SCI 大鼠的HO-1、NQO1 表達(dá)Tab.2 Injection of miR-210-5p modified MSCs derived exosomes promoted the expression of HO-1，NQO1 in SCI rats±s

表2 miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體促進(jìn)SCI 大鼠的HO-1、NQO1 表達(dá)Tab.2 Injection of miR-210-5p modified MSCs derived exosomes promoted the expression of HO-1，NQO1 in SCI rats±s

注：與假手術(shù)組比較，1P＜0.05，2P＜0.01；與模型組比較，4P＜0.05，5P＜0.01；與MSCs 組比較，nsP＜0.05；與MSCs-NC mimic 組比較，3P＜0.01；與miR-210-5p 外泌體組比較，6P＜0.01；與MSCs+ML385 組比較，7P＜0.05

組別/指標(biāo)假手術(shù)組模型組MSCs 組MSCs-NC mimic 組miR-210-5p 外泌體組MSCs+ML385 組miR-210-5p 外泌體+ML385 組HO-1 mRNA 1.0±0.04 0.2±0.022 0.4±0.044 0.41±0.03ns 0.93±0.063 0.35±0.04ns 0.46±0.036,7 NQO1 mRNA 1.0±0.04 0.3±0.022 0.5±0.054 0.48±0.02ns 0.92±0.033 0.4±0.04ns 0.6±0.036,7

3 討論

SCI 的發(fā)生會(huì)誘導(dǎo)多個(gè)miRNAs 的異常表達(dá)，引起繼發(fā)性損傷反應(yīng)，包括炎癥、凋亡和氧化應(yīng)激。越來越多的證據(jù)表明miRNAs 在SCI 的發(fā)病過程中發(fā)揮一定的生物學(xué)效應(yīng)［10-12］。例如，miR-384-5p 在SCI 大鼠中顯著下調(diào)，而miR-384-5p 的過表達(dá)可以通過抑制自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)SCI 大鼠的恢復(fù)［13］；miR-21-5p 通過PI3K/AKT 途徑減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和炎癥，促進(jìn)SCI 大鼠的恢復(fù)［14］。外泌體是一種新型的細(xì)胞間通信器，已被用作局部或全身輸送miRNA 的生物載體，用于治療各種疾病，包括脊髓損傷。例如，miR-133 修飾MSCs 外泌體促進(jìn)神經(jīng)元存活和軸突再生，改善脊髓損傷后后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)［15］；miR-544 修飾MSCs 源的外泌體通過減輕脊髓損傷后的炎癥，改善功能恢復(fù)并促進(jìn)神經(jīng)元存活［16］；microRNA-124 修飾骨髓MSCs 通過加速M(fèi)SCs 向神經(jīng)細(xì)胞的分化并促進(jìn)SCI 修復(fù)［17］。以上結(jié)果表明外泌體介導(dǎo)的miRNAs轉(zhuǎn)移是一種新的SCI 治療方法［18-19］。

本研究探討了外泌體介導(dǎo)的miR-210-5p 在SCI 治療中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-210-5p 外泌體注射顯著增加了SCI 大鼠的BBB 評(píng)分（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，MSCs 通過外泌體傳遞外源性miR-210-5p 以促進(jìn)大鼠SCI 后的功能恢復(fù)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)miR-210-5p分泌體組大鼠中GAP-43的表達(dá)被顯著抑制（P＜0.05），HO-1、NF、NQO1 的表達(dá)則被增強(qiáng)（P＜0.05），而Nrf2 的抑制劑ML385 逆轉(zhuǎn)了miR-210-5p 分泌體在SCI 大鼠中的作用。由此表明，miR-210-5p 外泌體能夠通過激活Keap1-Nrf2信號(hào)通路促進(jìn)SCI大鼠的修復(fù)。這與之前關(guān)于Keap1/Nrf2 信號(hào)通路在SCI 中的報(bào)道一致［20］。然而本研究并未在mRNA 水平上進(jìn)一步探討miR-210-5p 對(duì)SCI 大鼠Keap1-Nrf-2 通路影響，后期可進(jìn)一步深入分析。

綜上所述，miR-210-5p 修飾MSCs 源外泌體能夠通過活化SCI 大鼠的Keap1-Nrf-2 通路來促進(jìn)大鼠的SCI 修復(fù)。