楊利萍，張友蘭，唐鳳鳴，歐 揚，李 瑩

四川省人民醫(yī)院溫江醫(yī)院/成都市溫江區(qū)人民醫(yī)院,四川 成都 611000

肺心病即慢性肺源性心臟病，主要是由于肺組織結(jié)構(gòu)和功能病變，使肺血管的阻力和肺動脈壓力升高，從而造成右心室肥厚，并最終導致右心功能衰竭［1］，是一種高患病率、高死亡率的繼發(fā)性心臟病。研究［2］表明，肺血管病變誘發(fā)的肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是肺心病發(fā)病過程中的中心環(huán)節(jié)和先決條件。近年來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞損傷（endothelial cell damage，ECD）導致的內(nèi)皮功能失調(diào)是PAH 血管病變的基礎病理改變，因此尋找合適的藥物對ECD進行干預治療，是PAH 治療領域研究的熱點之一［3］。麻黃是我國寶貴的藥用植物，性味辛苦，具有宣肺平喘、發(fā)汗散寒、活血通絡等作用。研究［4］表明，麻黃堿能通過抑制炎癥減輕肺損傷和肺纖維化，有效抑制非小細胞肺癌細胞的增殖。然而，麻黃堿對肺動脈高壓的保護作用及機制研究尚未報道。研究［5］表明轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGFβ1）/信號轉(zhuǎn)導分子7（signal transduction molecule 7，Smad7）信號轉(zhuǎn)導通路在血管平滑肌細胞遷移、動脈壁脂質(zhì)沉積、動脈的炎性細胞浸潤、血管壁的氧化應激等血管生物學行為發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。ZENG Z 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ1/Smad7 在血管內(nèi)皮損傷動物模型中表達異常。本研究通過腹腔注射野百合堿構(gòu)建肺動脈高壓模型，從TGFβ1/Smad7 信號通路出發(fā)，探討麻黃堿對PAH 血管內(nèi)皮的作用機制，從而為臨床提供新的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物12～13 周齡的雄性SD 大鼠60只，體質(zhì)量在200～220 g，由四川省人民醫(yī)院溫江醫(yī)院動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：2019-0005A。飼養(yǎng)條件：依照實驗動物管理辦法，室溫下標準飼料、自由飲水、分籠（4 籠）適應性飼養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 試劑與儀器野百合堿（美國Sigma 公司，批號：012K7042）；鹽酸麻黃堿（赤峰制藥廠，北京中順制藥分裝，農(nóng)工藥準字1996 第000116 號）；（transforming growth factorβ1，TGF-β1）特異性抑制劑SB431542（美國Selleck 公司，批號：265412m）；TGF-β1、p-Smad2、p-Smad7 探針（Santa公司，批號：0502384）；二喹啉甲酸濃度測定試劑盒（bicin-choninic acid，BCA，批號：SP256421）；3，3-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）化學發(fā)光試劑盒（Sigma 公司，批號：SB382415）；蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術公司，批號：SM654388）；TGF-β1、p-Smad2、p-Smad7 抗體、兔抗3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）及山羊抗兔IgG（美國abcam 公司，批號：ab264432）；TUNEL、Western blot 試劑盒（德國Rebstock 公司，批號：2562224）。蘇凈Airtech 超凈工作臺（北京六一儀器廠）；LEICAEG1150 型組織包埋機（德國Leica 公司）；H-7650 型Nikon Ti-U/Ti-s 倒置熒光顯微鏡（日本三菱公司）；5810R型高速離心機（日本島津公司）；生物電鏡（美國Corning 公司）；E-Gel Imager 凝膠成像儀（美國Beckma公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模及分組 選擇12～13周齡的SD大鼠60 只，隨機分為正常組、模型組、治療組、抑制劑組，每組15 只。除正常組外，其余各組大鼠用無水乙醇與生理鹽水（2∶3）配成1%的野百合堿溶液，腹腔一次性注射構(gòu)建肺心病大鼠模型，正常組注射等體積生理鹽水。

1.3.2 給藥方法 造模后治療組和抑制劑組大鼠分別定時以10 mg/kg 麻黃堿和SB431542 灌胃給藥；正常組和模型組給予等劑量生理鹽水，所有大鼠每日給藥1次，連續(xù)給藥4周。

1.4 觀察指標

1.4.1 大鼠血壓及右心肥厚指數(shù) 連續(xù)給藥4周后，各組大鼠腹腔注射30 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉，參照文獻方法［7］采集記錄大鼠右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）和肺動脈壓（pulmonary artery pressure，PAP），計算右心肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy index，RVHI）。測量完畢后，腹動脈采血，低溫離心后，獲得血清，檢測血清中一氧化氧（nitricoxide，NO）和血漿中內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）的水平。將大鼠斷頭處死，留取各組大鼠的左側(cè)肺葉，液氮封存，轉(zhuǎn)移至深冷冰箱備用待測。

1.4.2 大鼠肺動脈病理學表現(xiàn) 從冰箱中取出各組大鼠肺動脈，制成石蠟切片，進行蘇木素伊紅、馬松染色，光鏡下觀察各組大鼠肺動脈血管的病理改變。

1.4.3 大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu) 從冰箱中取出各組大鼠肺動脈，分別制成0.3 cm×0.5 cm大小的超薄組織切片：采用2.5%戊二醛固定8 h，生理鹽水清洗3 次，梯度濃度乙醇脫水，維持-20℃冷凍干燥過夜，透射電鏡下觀察各組大鼠肺動脈血管的內(nèi)皮細胞超微病理結(jié)構(gòu)改變。

1.4.4 大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞凋亡 從冰箱中取出各組大鼠肺動脈，常規(guī)方法固定，冰凍切片，二甲苯浸洗兩次，梯度酒精浸洗5 min，風干后3%雙氧水-甲醇浸泡10 min，PBS漂洗3次，每次3 min，然后4℃預冷乙醇進行如下操作：0.1%TritonX-100、0.1%緩沖液處理2 min，PBS 漂洗3 次，每次3 min，加入TUNNEL 反應混合液，加封口膜在暗濕盒中反應1 h，溫度37℃，PBS 漂洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，熒光顯微鏡進行觀察，每組切片6 個不同的視野，并通過Image-Pro 6.2 軟件處理圖像［6］，進行統(tǒng)計分析得到各組大鼠的肺動脈血管的內(nèi)皮細胞的凋亡率。

1.4.5 氧化應激相關底物和酶 從大鼠眼眶取血，各組血清樣本在蛋白酶抑制劑作用下超聲溶解，以離心半徑15 cm，4000 r/min 離心5 min，收集上清液進行分析。采用蛋白測定試劑盒測定上清液蛋白濃度。參照試劑盒說明書的操作步驟，分別檢測各組血清樣本中總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、SOD 水平及MDA、活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量。

1.4.6 熒光原位雜交檢測各組大鼠肺動脈TGFβ1、Smad2、Smad7的mRNA的表達 從冰箱中取出各組大鼠肺動脈，10%甲醛固定，制成0.5μm石蠟切片，脫蠟，風干，加入蛋白酶K 反應液（100 mmol/l Tris-HCL，50 mmol/L EDTA 和1μg/mL 蛋白酶K，各1 mL 的混合液），在37°C 水浴中孵育20 min，用緩沖液沖洗3 次，通過酒精梯度脫水。加入1 mL 變性溶液（70%甲酰胺，2X SSC和0.1 mmol/L的EDTA，各1 mL的混合液），在75℃下孵育8 min，同時雜交含目的蛋白mRNA探針的溶液，在75℃下孵育8 min。每個載玻片區(qū)域覆蓋有50 μL 雜交混合物，將溶液置于濕箱中，并在42℃的烤箱中雜交過夜［7-8］。雜交后，幻燈片被洗脫，通過酒精梯度脫水并風干，在顯微鏡下觀察。

1.4.7 Western blot 檢測各組大鼠肺動脈TGFβ1、p-Smad2、p-Smad7 的表達水平 從冰箱中取出各組大鼠肺動脈，PBS 緩沖液沖洗2 次，研磨勻漿，冰上裂解30 min 后，離心獲得上清，蛋白濃度采用BCA試劑盒測定，每個樣品取50μg，然后進行SDS-PAGE 電泳、PVDF 轉(zhuǎn)膜、TBST 液封閉，維持4℃過夜孕育，然后分別加入一抗（TGFβ1，p-Smad2，p-Smad7）（1∶1500），孕育1 h，洗滌加入抗辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1∶10000），加入ECL顯色30 min，以GAPDH 作為內(nèi)參表示蛋白相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學方法采用軟件SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料采用±s進行表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用獨立t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血壓及RVHI水平與正常組比較，模型組大鼠RVSP、PAP和RVHI水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，藥物干預后，治療組和抑制劑組RVSP、PAP 和RVHI 水平均顯著下降（P＜0.05）；兩組各項指標比較，差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血壓及RVHI水平比較（±s）

表1 各組大鼠血壓及RVHI水平比較（±s）

注：1 mm Hg≈0.133 kPa；*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組治療組抑制劑組鼠數(shù)15 15 15 15 RVSP（mm Hg）34.31±3.24 97.61±8.06*54.74±5.18*#56.16±6.09*#PAP（mm Hg）21.65±2.52 60.15±3.32*31.69±2.96*#33.31±2.12*#RVHI（%）0.29±0.02 0.69±0.08*0.42±0.04*#0.44±0.05*#

2.2 大鼠血清NO、ET-1 含量與正常組比較，模型組大鼠血清NO 含量顯著下降（P＜0.05），ET-1的含量顯著上升（P＜0.05）。經(jīng)藥物干預后，與模型組比較，治療組、抑制劑組大鼠血清NO 含量顯著上升，ET-1 含量顯著下降（P＜0.05）；兩組各項指標比較，差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清中NO和ET-1含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清中NO和ET-1含量比較（±s）

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組治療組抑制劑組鼠數(shù)15 15 15 15 NO（μmol/L）45.38±5.12 21.60±3.07*34.21±3.26*#37.24±3.18*#ET-1（pg/L）93.27±11.29 136.19±15.74*109.87±12.87*#115.28±12.67*#

2.3 大鼠肺動脈氧化應激指標與正常組比較，模型組大鼠肺動脈ROS、MDA水平顯著增加，而SOD和T-AOC 水平顯著降低；與模型組比較，治療組、抑制劑組大鼠肺動脈ROS 和MDA 水平顯著降低，SOD和T-AOC水平顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療組、抑制劑組大鼠肺動脈ROS、MDA、SOD 和T-AOC 水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠氧化應激相關指標變化情況

2.4 大鼠肺動脈組織病理變化正常組HE 染色結(jié)果顯示，大鼠肺動脈血管壁光滑且富有彈性，血管壁厚度與血管管腔面積正常，內(nèi)膜層連續(xù)排列規(guī)整，通過Masson 染色，發(fā)現(xiàn)在視野中顯示出少量膠原纖維；模型組大鼠肺動脈血管僵硬度明顯增加，內(nèi)膜增厚明顯，管腔明顯變窄，管腔內(nèi)大量炎癥細胞填充，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)不規(guī)則，內(nèi)皮凸起、缺損嚴重，Masson 染色顯示血管壁和周圍組織中顯示出許多無序增殖的膠原纖維；治療組和抑制劑組大鼠的肺動脈在內(nèi)皮結(jié)構(gòu)、厚度、內(nèi)膜完整性，以及膠原纖維增生方面較模型組有明顯改善。見圖2。

圖2 各組大鼠肺動脈病理變化情況（A1-D1為HE染色，×400；A2-D2為Masson染色，×400）

2.5 大鼠肺動脈超微結(jié)構(gòu)改變正常組大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)整、連續(xù)，細胞間連接緊密，基底膜完整，無隆起與脫落現(xiàn)象，內(nèi)膜厚薄均勻，內(nèi)膜力膜平直，無彎曲，平滑肌細胞分布致密，彈力板未出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，胞漿內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)完整，性狀正常；模型組大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞增生，形狀失去穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，基底膜斷裂明顯，平滑肌細胞肥大，彈力板結(jié)構(gòu)不完整且斷裂，胞漿內(nèi)線粒體腫脹明顯，結(jié)構(gòu)缺損嚴重；治療組和抑制劑組大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞扁平、較為完整，線粒體空泡樣變性明顯好轉(zhuǎn)，內(nèi)膜力膜連續(xù)，厚度趨于均勻，中膜平滑肌細胞略見增生，彈力板結(jié)構(gòu)清晰，排列較為整齊。見圖3。

圖3 各組大鼠透射電鏡下肺動脈超微結(jié)構(gòu)變化（×6000）

2.6 大鼠肺動脈中內(nèi)皮細胞凋亡率與正常組比較，模型組大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞的凋亡率顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，經(jīng)過藥物干預后，治療組和抑制劑組大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）；治療組和抑制劑組比較，差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠肺動脈中內(nèi)皮細胞凋亡率

2.7 大 鼠 肺 動 脈 中TGFβ1、p-Smad2 及p-Smad7mRNA及蛋白表達與正常組比較，模型組大鼠肺動脈中TGFβ1、p-Smad2及p-Smad7的mRNA熒光強度明顯增強（P＜0.05），蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，治療組和抑制劑組大鼠肺動脈中TGFβ1和p-Smad2 的mRNA 熒光強度明顯減弱，蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；p-Smad7 的mRNA 熒光強度明顯增強，蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）；治療組和抑制劑組大鼠肺動脈的TGFβ1、p-Smad2及p-Smad7的mRNA及蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5—6。

圖5 各組大鼠肺動脈TGFβ1、p-Smad2及p-Smad7蛋白表達

圖6 各組大鼠肺動脈TGFβ1、p-Smad2 及p-Smad7 mRNA 表達（A1-D1，×200；A2-D2，×400；A3-D3，×800）

3 討論

肺心病是一種嚴重的呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)疾病，具有較高的患病率及病死率。相關研究［8］表明，PAH 是肺心病發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)，而血管結(jié)構(gòu)，特別是內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能改變是PAH 的基礎病理生理因素。因此，近年來越來越多的研究開始針對內(nèi)皮細胞進行干預，用以治療PAH。麻黃堿是中藥麻黃的主要成分，研究［9］報道麻黃堿可通過抑制血管炎癥來減輕肺損傷和肺纖維化，對肺心病有一定的治療作用。本研究采用腹腔注射野百合堿構(gòu)建肺動脈高壓模型，然后觀察麻黃堿治療PAH的效果。結(jié)果顯示模型組大鼠的RVSP、PAP和RVHI 水平均顯著升高，而藥物干預后，治療組的RVSP、PAP和RVHI水平均顯著下降，結(jié)果提示麻黃堿對PAH大鼠具有一定的保護作用。

相關研究［10］表明，NO和ET-1兩者的平衡對于血管舒縮功能的維持具有重要意義。STEVEN S［11］研究報道，肺動脈高壓患者血漿中ET-1 升高，NO水平降低，肺動脈血管處于高度收縮狀態(tài)，形成肺動脈高壓，導致血管功能障礙。本研究中，PAH 模型組大鼠血清中ET-1的水平顯著升高，NO水平顯著下降，藥物干預后可顯著降低大鼠血清ET-1 水平，升高NO 水平，說明麻黃堿改善內(nèi)皮功能的作用機制與降低血清ET-1 水平、升高NO 水平有關。ROS 是一類廣泛存在于生物體中富含有氧元素的物質(zhì)，當機體受到刺激后，過剩的ROS 可導致多種組織出現(xiàn)氧化應激損傷［12］。SOD 是氧化應激反應中主要的抗氧化劑，機體抗氧化系統(tǒng)主要受SOD和MDA 的動態(tài)平衡維持。許良葵［13］研究表明，麻黃堿可通過抑制ROS 的產(chǎn)生來抑制細胞凋亡，從而幫助血管內(nèi)皮細胞抵抗H2O2誘導的氧化應激。本研究發(fā)現(xiàn)，應用麻黃堿干預后，大鼠ROS 和MDA水平顯著降低，而SOD 和T-AOC 水平顯著升高，說明麻黃堿對PAH 引起的氧化應激反應具有一定的緩解作用，該結(jié)果與既往實驗結(jié)果［13］一致，再次證實了藥物的治療效果。

PAH 發(fā)病機制尚未明確，文獻報道［14］稱內(nèi)皮細胞凋亡在PAH 發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，內(nèi)皮細胞過度凋亡會促進循環(huán)系統(tǒng)障礙，因此阻斷內(nèi)皮細胞凋亡可以改善PAH。本研究染色結(jié)果顯示，模型組大鼠肺動脈血管僵硬度明顯增加，內(nèi)膜增厚明顯，管腔明顯變窄，管腔內(nèi)有大量炎癥細胞填充，內(nèi)皮凸起、缺損嚴重，且血管壁和周圍組織中顯示出許多無序增殖的膠原纖維。進一步觀察超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞增生，失去穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，基底膜斷裂明顯，平滑肌細胞肥大，彈力板結(jié)構(gòu)不完整且斷裂，胞漿內(nèi)線粒體腫脹明顯，結(jié)構(gòu)缺損嚴重，這提示PAH 大鼠的肺動脈組織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。治療組肺動脈在內(nèi)皮結(jié)構(gòu)、厚度、內(nèi)膜完整性，以及膠原纖維增生方面較模型組有明顯改善，提示麻黃堿可以明顯改善PAH 大鼠肺動脈組織。李中燕［15］研究顯示，麻黃堿可以明顯抑制支氣管哮喘內(nèi)皮細胞凋亡，本研究中TUNNEL 染色結(jié)果顯示，模型組大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞凋亡明顯，凋亡指數(shù)明顯高于正常組，而藥物干預處理后，凋亡指數(shù)明顯下降，提示麻黃堿能夠抑制肺動脈內(nèi)皮細胞凋亡，起到保護血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的作用。

文獻報道［16］顯示，TGFβ1/Smad7 是與血管生物學行為密切相關的信號通路，在血管內(nèi)皮細胞形態(tài)維持、平滑肌細胞黏附與遷移以及血管中膜細胞收縮等多種細胞生物學行為發(fā)揮關鍵的調(diào)控作用。YAO W 等［17］研究表明抑制TGFβ1的表達、上調(diào)p-Smad7 的表達能明顯改善由炎性因子誘導的內(nèi)皮功能障礙。本研究中，用TGFβ1/Smad7信號通路特異性抑制劑SB431542灌胃處理PAH大鼠來觀察TGFβ1/Smad7 信號通路的作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制劑組的結(jié)果與治療組大鼠無明顯差異，能夠改善PAH 大鼠中肺動脈血管的內(nèi)皮損傷。原位熒光和Western blot 結(jié)果表明，模型組大鼠肺動脈中TGFβ1、p-Smad2 及p-Smad7 的mRNA 熒光強度明顯增強，各蛋白的相對表達量顯著升高；治療組和抑制劑組大鼠肺動脈中TGFβ1、p-Smad2 的mRNA 熒光強度明顯減弱，p-Smad7 的mRNA 熒光強度明顯增強，TGFβ1、p-Smad2 蛋白的表達顯著下降，p-Smad7蛋白的表達顯著升高。推斷麻黃堿可能通過抑制TGFβ1和p-Smad2 的表達，上調(diào)p-Smad7 的表達來發(fā)揮其對PAH脈血管內(nèi)皮的保護作用。

綜上所述，麻黃堿對PAH 肺動脈血管內(nèi)皮的保護作用，與TGFβ1/Smad7 信號通路有關，其機制可能是抑制TGFβ1和p-Smad2的表達，上調(diào)p-Smad7的表達，來降低氧化應激反應，抑制內(nèi)皮細胞凋亡，發(fā)揮對PAH肺動脈血管內(nèi)皮的保護作用。