孫 鶯，王玉梅，尉 鵬，楊平榮，謝親建，郭小雨

1 甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730000；2 國(guó)家藥監(jiān)局中藥材及飲片質(zhì)量控制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 武警甘肅省總隊(duì)醫(yī)院；4 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

中藥飲片是指依據(jù)我國(guó)傳統(tǒng)的中醫(yī)藥理論，將中草藥進(jìn)行加工炮制可，直接應(yīng)用于中醫(yī)臨床或制劑生產(chǎn)應(yīng)用的處方藥品［1］。它是一種特殊的藥品類型，介于農(nóng)產(chǎn)品和藥品之間，它的品質(zhì)直接影響藥物臨床使用的安全性和效果［2-4］。微生物污染是飲片外源性污染的主要形式之一，也是影響人體健康的重要途徑［5］，不只對(duì)飲片本身和它加工所得的中成藥產(chǎn)物的質(zhì)量?jī)?yōu)劣和使用安全產(chǎn)生影響［6-8］，并且被微生物污染過(guò)的藥品物理、化學(xué)性質(zhì)也可能會(huì)產(chǎn)生變化，從而使藥品有效性下降，甚至被微生物和酶降解的產(chǎn)品，使用后輕者會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)，重者或出現(xiàn)生命危險(xiǎn)［9］。

迄今為止，《歐洲藥典》（European pharmacopoeia，EP）、《美國(guó)藥典》（United States pharmacopoeia，USP）、日本藥局方（Japanese pharmaceutical agency，JPA）［10］都收載了植物藥或天然藥的微生物檢查方法和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，如需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌的檢查。在現(xiàn)行的2015 版《中華人民共和國(guó)藥典》［11］（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》），增加了針對(duì)研粉口服用貴細(xì)飲片、直接口服及泡服飲片中控制菌沙門菌和耐膽鹽革蘭陰性菌的限度要求，但還沒(méi)有對(duì)需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的限度要求。

研究近年文獻(xiàn)，我們可以看到我國(guó)當(dāng)前較高的中藥飲片的微生物負(fù)載量，而且各種中藥飲片的微生物污染量差別很大，迫切需要解決衛(wèi)生方面的質(zhì)量安全問(wèn)題［12-17］。

甘肅是全國(guó)中藥材資源大省，素有“千年藥鄉(xiāng)”之稱，特別是道地藥材種植形成一定規(guī)模。本研究以兩類甘肅道地藥材當(dāng)歸、黨參中藥飲片為研究對(duì)象，考察其微生物污染狀況，初步掌握微生物污染負(fù)載水平，為中藥飲片微生物污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和微生物標(biāo)準(zhǔn)的制定提供數(shù)據(jù)支持，從而推動(dòng)中藥飲片產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

1 材料與儀器

1.1 中藥飲片本研究所用甘肅省市售當(dāng)歸中藥飲片共31 批樣品，來(lái)源于甘肅、安徽、河北、陜西的26 個(gè)不同廠家。市售黨參中藥飲片共30 批樣品，來(lái)源于河北、陜西、甘肅、安徽的23 個(gè)不同廠家。

1.2 試劑pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液（批號(hào)：20191102）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（tryptone agar medium for soybean，TSA）（批號(hào)：20190930）；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（tryptone liquid medium for soybean，TSB）（批號(hào)：20191212）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（sabouraud dextrose agar，SDA）（批號(hào)：20190912）；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（amaranth bile salt glucose agar medium）（批 號(hào)：20190930）；腸道增菌液體培養(yǎng)基（Intestinal bacterial augmentation liquid medium）（批號(hào)：20191130）；RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（RV Liquid medium for salmonella augmentation）（批 號(hào)：20191102）；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（Xylose lysine deoxycholate AGAR medium，XLD）（批號(hào)：20181124）；三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（triple sugar iron agar medium，TSI）（批號(hào)：20190930）。以上試劑均購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器SW-CJ-2D 型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；ClassⅡBSC 型生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；BPMJ-250F 型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Veriti 型PCR儀（美國(guó)賽默飛科技公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

參照《中國(guó)藥典》2015 年版中“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查微生物計(jì)數(shù)法”（通則1105）和“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查控制菌檢查法”（通則1106）進(jìn)行檢查［14］。

2.1 供試品溶液的制備稱取10 g樣品，加入到100 mLpH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液中，振蕩，制成1∶10的供試品溶液。

2.2 需氧菌總數(shù)(TAMC）計(jì)數(shù)取“2.1”項(xiàng)下1∶10供試液，用pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍稀釋至1×10-5，采用平皿法計(jì)數(shù)，1 mL/皿，平行制備2 個(gè)平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，33℃培養(yǎng)5天。

2.3 霉菌和酵母菌總數(shù)(TYMC)的測(cè)定取“2.1”項(xiàng)下1∶10 供試液，用pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍梯度稀釋至1×10-4，采用平皿法計(jì)數(shù)，1 mL/皿，平行制備2個(gè)平皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，23℃培養(yǎng)7天。

2.4 控制菌的檢查

2.4.1 耐膽鹽革蘭陰性菌（bile-tolerant gramnegitive bacteria，BGB） 取“2.1”項(xiàng)下1∶10 供試液，按照2015 年版《中國(guó)藥典》四部通則“微生物計(jì)數(shù)法”［14］進(jìn)行耐膽鹽革蘭陰性菌的定量檢查和定性檢查。取1×10-1、1×10-2和1×10-3供試品稀釋液1 mL 分別接種至10 mL 腸道增菌液體培養(yǎng)基中，35℃下培養(yǎng)48 h。取相當(dāng)于l g樣品的上述預(yù)培養(yǎng)物接種至100 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24 h 后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，33℃培養(yǎng)24 h。

2.4.2 沙門菌 取飲片樣品10 g，接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL 內(nèi)，33℃下培養(yǎng)48 h。取上述培養(yǎng)物0.1 mL 接種至10 mLRV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，33℃下培養(yǎng)48 h。取少量RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，33℃下培養(yǎng)48 h。

3 結(jié)果

3.1 需氧菌總數(shù)檢測(cè)結(jié)果將需氧菌總數(shù)（TAMC）的結(jié)果取對(duì)數(shù)（以IgTAMC 表示）。以飲片品種為橫坐標(biāo)、IgTAMC 值為縱坐標(biāo)作箱式圖，結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。本次試驗(yàn)所選取的61個(gè)批次中藥飲片均檢出需氧菌，IgTAMC 的均值為3.32，最小值為2.05，最大值為6.30。61批飲片樣品的IgTAMC 值均小于7.0，整體水平符合歐洲、日本藥典標(biāo)準(zhǔn)。61 批樣品中只有1 批當(dāng)歸飲片IgTAMC 值超過(guò)6.0，即98.4%的飲片符合歐洲、美國(guó)、日本藥典標(biāo)準(zhǔn)。各國(guó)藥典與中藥飲片相當(dāng)?shù)闹参锼幓蛏幍奈⑸锵薅戎狄?jiàn)表2。當(dāng)歸飲片的IgTAMC 值為2.60～6.30，表明其污染的TAMC 各批間差異較大，質(zhì)量不穩(wěn)定；黨參飲片的IgTAMC 值為2.05～5.05，表明其污染的TAMC 較當(dāng)歸低，且各批間差異小。

表1 飲片樣品TAMC和TYMC測(cè)定結(jié)果

圖1 中藥飲片樣品中需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果

3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)檢測(cè)結(jié)果酵母菌和霉菌也是中藥飲片中常見(jiàn)的污染菌，部分霉菌會(huì)產(chǎn)生有毒代謝物，危害極大。本試驗(yàn)中兩種飲片共61 批樣品均檢出酵母菌和霉菌，以飲片品種為橫坐標(biāo)、酵母菌和霉菌總數(shù)的Ig 值為縱坐標(biāo)作箱式圖，見(jiàn)圖2，由圖可知，61 批次中藥飲片IgTYMC 的均值為1.69，最小值為0.70，最大值為3.23，表明這2 種飲片樣品的TYMC 負(fù)載相對(duì)較低。31 批當(dāng)歸中藥飲片，IgTYMC 值為0.70～3.23，IgTYMC 最大值為3.23，IgTYMC 值總體均數(shù)為1.86；30 批黨參中藥飲片樣品，IgTYMC最大值為2.49，IgTYMC值總體均數(shù)1.52。約60%的當(dāng)歸飲片樣品IgTYMC介于1.50～2.00，約67%的黨參樣品IgTYMC 介于1.25～2.00；所有飲片中，僅當(dāng)歸中的1 批樣品IgTYMC大于3.00，其余所有飲片樣品IgTYMC均小于3.00。結(jié)果表明61 批當(dāng)歸和黨參中藥飲片均符合《美國(guó)藥典》《歐洲藥典》《日本藥典》限度標(biāo)準(zhǔn)，不同批次樣品之間差別小，質(zhì)量穩(wěn)定，見(jiàn)表2。當(dāng)歸飲片的霉菌和酵母菌污染程度高于黨參飲片。

圖2 中藥飲片樣品中酵母菌和霉菌總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果

表2 各國(guó)藥典與中藥飲片相當(dāng)?shù)闹参锼幓蛏幍奈⑸锵薅戎?/p>

3.3 控制菌測(cè)定結(jié)果

3.3.1 耐膽鹽革蘭陰性菌 61 批中藥飲片中，29 批檢出耐膽鹽革蘭陰性菌，占47.5%，其中當(dāng)歸24 批，黨參5 批，分別占各自批數(shù)的77.0%和16.7%。不同批次和來(lái)源的同種飲片耐膽鹽革蘭陰性菌差別很大，黨參飲片耐膽鹽革蘭陰性菌污染程度較低，明顯低于當(dāng)歸飲片。

3.3.2 沙門菌檢測(cè) 經(jīng)檢驗(yàn)，61 批飲片中均未檢出沙門菌。

4 討論

甘肅是我國(guó)中藥材種植最大省份之一，當(dāng)歸和黨參又是甘肅的道地大宗中藥材。這兩種根類藥材，因生長(zhǎng)在土壤中，較長(zhǎng)時(shí)間接觸到土壤中的有害元素和各種微生物，容易受到栽種的環(huán)境、肥料的影響，也容易受到外來(lái)微生物的污染。為了加強(qiáng)中藥飲片在臨床上使用的安全有效，本研究以市售甘肅道地藥材當(dāng)歸和黨參中藥飲片為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，參照《中國(guó)藥典》（2015 版）四部通則的非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查方法，從TAMC、TYMC、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌這四方面對(duì)微生物污染水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。因?yàn)椤吨袊?guó)藥典》（2015 版）當(dāng)前對(duì)需氧菌總數(shù)、酵母菌和霉菌總數(shù)限度標(biāo)準(zhǔn)未做出要求，本文從現(xiàn)行《美國(guó)藥典》《歐洲藥典》《日本藥典》三方面進(jìn)行判定。

研究結(jié)果顯示，甘肅省市售的61 批當(dāng)歸和黨參中藥飲片均檢出需氧菌、酵母菌和霉菌，61批飲片需氧菌總數(shù)平均值超過(guò)103CFU/g，最大值超過(guò)106CFU/g。霉菌及酵母菌總數(shù)平均值達(dá)到102CFU/g，最大值超過(guò)103CFU/g，耐膽鹽革蘭陰性菌檢出率47.5%，全部飲片樣品都沒(méi)有檢出含沙門菌，可見(jiàn)微生物負(fù)載量較高，污染程度依舊相當(dāng)嚴(yán)重，各中藥飲片樣品的微生物負(fù)載量差異很大，同一市售廠家同種中藥飲片不同批次之間微生物污染程度差異也很大［15-17］。

我國(guó)中藥飲片品種多，生產(chǎn)、流通、經(jīng)營(yíng)各個(gè)環(huán)節(jié)都可能帶入外源性污染，威脅用藥安全。較中成藥而言，中藥飲片微生物限度要求很長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)一直被人們所忽視，數(shù)據(jù)資料顯示我國(guó)中藥飲片的載菌量偏高，已經(jīng)對(duì)中藥飲片本身和飲片所制得的中成藥的品質(zhì)和使用的安全產(chǎn)生了很大影響，但建立健全的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)必定需要大量數(shù)據(jù)的支持，而我國(guó)中藥產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀決定了這還需要很長(zhǎng)一段時(shí)間的努力才可實(shí)現(xiàn)?；诒狙芯拷Y(jié)果，應(yīng)將微生物檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)與我國(guó)國(guó)情相結(jié)合，把握飲片質(zhì)量現(xiàn)狀，制定出合理的標(biāo)準(zhǔn)，全面評(píng)估中藥飲片微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)一步加大過(guò)程監(jiān)控力度，強(qiáng)化中藥飲片的生產(chǎn)環(huán)節(jié)，減小中藥飲片臨床利用的安全隱患，增強(qiáng)藥品質(zhì)量安全，推進(jìn)我省中藥飲片行業(yè)健康發(fā)展，為行業(yè)發(fā)展助力。