江山 奚雷 孫楊

結(jié)核性膿胸手術(shù)常存在時(shí)間長(zhǎng)，術(shù)中易出血，術(shù)后康復(fù)時(shí)間長(zhǎng)，圍術(shù)期管理相對(duì)復(fù)雜的特點(diǎn)[1]。該類患者凝血功能較差，其中抗結(jié)核藥物會(huì)損傷肝腎功能，進(jìn)而會(huì)對(duì)凝血功能產(chǎn)生影響[2]。但臨床常用的異煙肼和利福平這兩種藥物是否會(huì)對(duì)患者體內(nèi)凝血功能產(chǎn)生直接影響目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。血栓彈力圖可以直觀性的觀察到藥物對(duì)凝血功能的影響[3-4]，較傳統(tǒng)凝血功能檢測(cè)更具有整體性、動(dòng)態(tài)性的評(píng)估[5-7]。本研究擬通過(guò)血栓彈力圖技術(shù)觀察異煙肼和利福平這兩種抗結(jié)核藥物分別對(duì)人體凝血功能的直接影響，進(jìn)一步探討兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，是否會(huì)對(duì)人凝血功能產(chǎn)生直接的相加或協(xié)同作用；為臨床上結(jié)核性膿胸患者圍術(shù)期可能存在的凝血功能紊亂的原因提供一定的實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象的選擇

本研究獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)：2019-KL002-01)，所有入組患者均簽署知情同意書。選擇2019年1月至2019年10月招募的64例志愿者。納入標(biāo)準(zhǔn)為：1)年齡在25至60歲之間；2)身高體重指數(shù)(BMI)≤30 kg/m2；3)受試前肝腎功能檢查未見(jiàn)異常；4)無(wú)凝血相關(guān)性疾病病史。排除標(biāo)準(zhǔn)為：1)患有嚴(yán)重心臟疾病、內(nèi)分泌和代謝疾病、神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)疾病、水，電解質(zhì)，酸堿平衡失調(diào)者；2)肝、腎功能不全者；3)存在嚴(yán)重感染者；4)存在血液系統(tǒng)相關(guān)疾病者；5)有腫瘤史或既往接受放化療史；6)糖尿病患者；7)正在接受抗凝治療者。

二、研究流程

采用隨機(jī)數(shù)字表法，采集每位志愿者的血樣分配至下列四組：對(duì)照組(NS組)，異煙肼組(I組)、利福平組(R組)和聯(lián)合藥物組(C組)。每組各志愿者均采集兩份血樣，一份加入抗凝管中作為基線血樣(分別記為NS-基線、I-基線、R-基線和C-基線)，另一份加入預(yù)處理后的抗凝管中(處理方式見(jiàn)下文，按組別，分別記為NS、I、R和C)。所有抗凝管均用有色紙張覆蓋表面，采血者和進(jìn)行血栓彈力圖分析的操作者，均不知曉分組情況。

三、志愿者血樣的采集

所有志愿者統(tǒng)一經(jīng)左肘靜脈采集血樣。采用22 G穿刺針和管道，操作者戴無(wú)菌手套，常規(guī)皮膚消毒后進(jìn)行穿刺采血。每位志愿者先采集2 mL靜脈血留作基線血樣；再采集1.9 mL靜脈血樣，加入預(yù)處理后的抗凝管中(預(yù)處理方式見(jiàn)下文)，兩組血樣靜置15分鐘后行血栓彈力圖檢測(cè)。

四、抗凝試管預(yù)處理

本研究使用3.2 %檸檬酸鈉負(fù)壓管作為抗凝采血管，各組在抗凝管中加入等容量的試劑。其中NS組加入0.1 mL含0.9 %的氯化鈉溶液，I組加入0.1 mL異煙肼試劑(含異煙肼12 μg)；R組加入0.1 mL利福平試劑(含利福平48 μg)；C組加入0.1 mL異煙肼和利福平的混合試劑(含異煙肼12 μg和利福平48 μg)。

五、觀察指標(biāo)

主要觀察指標(biāo)包括各組中基線血樣和加入試劑后血栓彈力圖檢測(cè)的結(jié)果，包括R時(shí)間、K時(shí)間、α角度、MA值等參數(shù)，并通過(guò)配套軟件計(jì)算血塊強(qiáng)度G值和綜合凝血指數(shù)CI。其它觀察指標(biāo)有志愿者的一般情況，包括年齡、性別、身高體重指數(shù)(BMI)、術(shù)前血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白濃度、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、尿素氮和肌酐的濃度、鈣離子、傳統(tǒng)凝血功能檢測(cè)，包括凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APPT)、纖維蛋白原(FIB)、凝血酶時(shí)間(TT)、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化率(INR)、D-二聚體(D-D)的值。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

七、樣本含量的計(jì)算

本研究通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合血栓彈力圖中的綜合凝血指數(shù)(CI)推算樣本含量。預(yù)實(shí)驗(yàn)共納入8位志愿者，結(jié)果提示，異煙肼聯(lián)合利福平組的CI值均低于生理鹽水組和利福平組(-13.69±7.63vs. -8.63±4.24 ；-13.69±7.63vs. -7.87±3.25)；異煙肼組CI值低于利福平組(-12.82±5.50vs. -7.87±3.25)；而生理鹽水組和利福平組未見(jiàn)明顯差異。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)各組所獲得的CI值，計(jì)算得效應(yīng)量為0.48，設(shè)雙側(cè)α=0.05，檢驗(yàn)效能β為80 %，數(shù)據(jù)缺失率為20 %，采用G-power 3.1.9.2軟件計(jì)算樣本大小，計(jì)算得共需64例患者。

結(jié) 果

一、四組志愿者的一般情況比較

最終共64位志愿者參與了本次研究，每組志愿者均有16位。四組志愿者受試前的年齡、性別、身高體重指數(shù)(BMI)、術(shù)前血小板(PLT)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、血紅蛋白(Hb)；傳統(tǒng)凝血功能檢測(cè)術(shù)前凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原含量(FIB)、D-二聚體(D-D)和鈣離子進(jìn)行比較，分別進(jìn)行兩兩比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 四組志愿者一般資料

二、各組血栓彈力圖的分析

1.基線血樣分析：將各組基線血樣進(jìn)行血栓彈力圖檢測(cè)，結(jié)果中各組的血栓彈力圖各參數(shù)比較均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見(jiàn)圖1A～F)。

圖1 四組基線血樣的血栓彈力圖結(jié)果

2.預(yù)處理后各組血樣分析：四組血栓彈力圖參數(shù)中R時(shí)間組間比較有差異，進(jìn)一步多重比較，I組時(shí)間長(zhǎng)于NS組和R組(P<0.05)；K時(shí)間組間比較有差異，進(jìn)一步多重比較，I組和C組的K時(shí)間均長(zhǎng)于NS組和R組(P<0.05)。α角度組間比較有差異，進(jìn)一步多重比較，I組和C組的α角度均小于NS組和R組(P<0.05)；最大強(qiáng)度MA值組間比較有差異，進(jìn)一步多重比較，I組和C組的MA值均小于NS組和R組(P<0.05)；軟件計(jì)算所得的血塊強(qiáng)度計(jì)算值 G值在組間比較有差異，進(jìn)一步多重比較，I組和C組的G值均小于NS組和R組(P<0.05)；軟件計(jì)算反映綜合凝血功能的計(jì)算值CI組間比較有差異，進(jìn)一步多重比較，I組和C組的CI值均小于NS組和R組(P<0.05)(見(jiàn)圖2A～F)。

圖2 四組加入試劑血樣的血栓彈力圖結(jié)果

討 論

本研究提示，在體外離體血模型下，抗結(jié)核藥物中，異煙肼和異煙肼聯(lián)合利福平可能會(huì)對(duì)血液有直接的抗凝作用，未見(jiàn)異煙肼和利福平聯(lián)合用藥，會(huì)對(duì)離體血凝血功能有明顯的相加或者協(xié)同作用。

接受抗結(jié)核治療的患者存在治療周期長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)差、肝臟功能受損、結(jié)核菌毒素在體內(nèi)釋放等，患者會(huì)存在凝血功能的異常。在導(dǎo)致凝血功能異常的諸多原因中，抗結(jié)核藥物對(duì)凝血功能的直接影響尚無(wú)相關(guān)研究[8]。目前圍術(shù)期抗結(jié)核藥物的應(yīng)用強(qiáng)調(diào)聯(lián)合、規(guī)律、全程的原則，一般在入院前采用口服四聯(lián)抗結(jié)核藥物治療方案(異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇)；入院后患者常將口服四聯(lián)藥物改為靜脈給予異煙肼和利福平強(qiáng)化治療，為防止手術(shù)過(guò)程中可能造成的結(jié)核菌播散和術(shù)后結(jié)核耐藥菌的復(fù)發(fā)，故異煙肼和利福平的應(yīng)用常持續(xù)至手術(shù)當(dāng)日[9]。一些文獻(xiàn)提示，異煙肼可能會(huì)對(duì)凝血階段ⅩⅢ因子的活性有一定的影響，而活化的ⅩⅢ因子對(duì)纖維蛋白單體和血小板的交互交織起到重要的作用，其因子活性的降低會(huì)直接影響到血凝塊的強(qiáng)度和穩(wěn)定性[4]。本研究中異煙肼和異煙肼聯(lián)合利福平的血栓彈力圖中，K值延長(zhǎng)和α角度的降低，提示血凝塊交織的過(guò)程緩慢，而MA值和G值的降低反映了血凝塊強(qiáng)度的下降，提示形成的血凝塊的剛度和穩(wěn)定性較差。盡管利福平在臨床研究中提示可能會(huì)對(duì)一些藥物的抗凝作用產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)[10-11]，不過(guò)在本研究中，利福平在體外研究中并未發(fā)現(xiàn)存在協(xié)同效應(yīng)。

本研究選擇了志愿者的體外離體血模型來(lái)監(jiān)測(cè)抗結(jié)核藥物對(duì)凝血功能的影響，其原因有：一，長(zhǎng)期應(yīng)用異煙肼或(和)利福平會(huì)產(chǎn)生肝臟或者腎臟的損傷，肝腎功能的異?？赡軙?huì)對(duì)機(jī)體的凝血功能產(chǎn)生影響[12]；二，兩種抗結(jié)核藥物在短期應(yīng)用時(shí)的血藥濃度個(gè)體化差異很大，如在體內(nèi)應(yīng)用后，血藥濃度的變化和代謝產(chǎn)物的影響可能會(huì)干擾整個(gè)凝血階段的進(jìn)程，繼而會(huì)對(duì)血栓彈力圖的結(jié)果產(chǎn)生一定影響[13]；三，該模型可以實(shí)現(xiàn)通過(guò)采用固定的抗結(jié)核藥的藥物濃度對(duì)凝血功能進(jìn)行觀察；四，采用血栓彈力圖技術(shù)可以反映抗結(jié)核藥物對(duì)凝血功能的整體變化，易于發(fā)現(xiàn)抗結(jié)核藥物對(duì)全血凝血功能的階段性的影響[5]。

本研究在藥物濃度的確定中選取了最新版Park J.S.等[14]制訂的異煙肼和利福平在臨床上治療劑量血藥濃度的中位數(shù)。主要考慮是兩種抗結(jié)核藥物在個(gè)體的藥代動(dòng)力學(xué)差異，可能會(huì)導(dǎo)致抗結(jié)核藥物血藥濃度的波動(dòng)范圍較大有時(shí)甚至?xí)稣５难帩舛确秶?，?huì)對(duì)最終結(jié)果的判讀產(chǎn)生一定影響，選用中位數(shù)濃度可以較好的觀察兩種藥物在臨床相關(guān)濃度中對(duì)凝血功能的影響。查閱知異煙肼的血藥濃度范圍為3～6 μg/mL，而利福平的血藥濃度范圍為8～24 μg/mL，本研究中異煙肼選用的濃度為該藥的中位數(shù)4.5 μg/mL，利福平選用的是對(duì)應(yīng)濃度的中位數(shù)16 μg/mL[14]。

由于血栓彈力圖操作中會(huì)加入的激活劑以提高檢驗(yàn)效能，臨床上常用高嶺土作為激活劑，其通過(guò)激活Ⅻ因子啟動(dòng)內(nèi)源性凝血通路激活凝血系統(tǒng)，加快凝血塊的形成速率；但其激活方式可能會(huì)對(duì)血栓彈力圖的輸出結(jié)果產(chǎn)生一定的影響[15]。故本研究中均未采用激活劑對(duì)全血進(jìn)行激活處理，以盡可能的減少激活劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，保證了實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。

本研究的局限性如下：一，本研究為體外研究，而體內(nèi)一些更為復(fù)雜的凝血因子(如蛋白C系統(tǒng)、抗凝血酶系統(tǒng)和組織因子途徑抑制物等)也可能會(huì)對(duì)凝血結(jié)果產(chǎn)生一定的影響；二，考慮到抗結(jié)核藥物在體內(nèi)的血藥濃度，可能會(huì)有不同程度的差異，因此不同血藥濃度的抗結(jié)核藥物對(duì)凝血功能的直接影響尚需進(jìn)一步研究；三，本研究觀察了圍術(shù)期常用的藥物異煙肼和利福平對(duì)凝血功能的直接影響，抗結(jié)核治療中的其它藥物，如乙胺丁醇和吡嗪酰胺是否也會(huì)對(duì)凝血功能產(chǎn)生直接影響，有待進(jìn)一步的探究。

總之，在離體血模型中，通過(guò)血栓彈力圖提示抗結(jié)核藥物中異煙肼可能會(huì)對(duì)血樣產(chǎn)生低凝效應(yīng)，而異煙肼聯(lián)合利福平產(chǎn)生的低凝狀態(tài)未見(jiàn)明顯的協(xié)同和相加作用。