吳鵬飛 但夢霞 邱立志 弋可 王洪州 薛培麗

放射性肺纖維化的發(fā)病機理中，TGF-β1/smads通路有重要作用，TGF-β1升高不僅能促進巨噬細胞等向肺部游走、釋放炎性因子，還能激活成纖維細胞，促使細胞外基質(zhì)異常重塑，致纖維化[1-3]。而抑制smad3蛋白表達，肺組織損傷程度顯著減輕[4]。吡非尼酮等抗纖維化藥物價格貴、副作用多，因此需要尋找新的治療手段。

細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)作為細胞骨架，還具有調(diào)節(jié)免疫、改善纖維化等功效[5-7]。Ghuman等將ECM制成液體，注入大腦局部，發(fā)現(xiàn)其可以長期附著并發(fā)揮良好修復作用[8]。因此，細胞外基質(zhì)具有很高的臨床應用價值，研究顯示：氣管內(nèi)注射水凝膠，可降低放射性肺損傷大鼠血清TGF-β1水平[9]。因此，我們推測：肺ECM水凝膠可能是通過抑制TGF-β1/Smad3通路發(fā)揮抗纖維化作用。

資料與方法

一、制備肺ECM水凝膠

麻醉大鼠(4%戊巴比妥)，全身肝素化，肺動脈插管，分離肺組織[10]。將收獲的肺ECM制成凍干粉并滅菌，-80℃保存。消化肺ECM凍干粉，磁力攪拌48 h，滴定pH至7.4，10×PBS稀釋至1×PBS。

二、放射性肺纖維化模型制備

取大鼠，麻醉，仰臥固定。胸部之外用鉛板遮擋， 20 Gy照射1次。

三、分組及處理

27只大鼠，隨機分為3組(n=9)：Control組、IR+NS組、IR+ECM組：Control組為陰性對照組， IR+NS組在造模后0.5 h氣管內(nèi)注射0.9%氯化鈉500 μl，IR+ECM組以同樣方式注射等量肺ECM水凝膠，觀察點：造模后第16周。

四、肺系數(shù)

處死大鼠時，稱體重，處死后取肺，濾紙吸干后稱重，為濕重，肺濕重(mg)/體重(g)×100記為肺系數(shù)。

五、病理學檢測

取部分左肺組織，4%多聚甲醛固定72 h， H&E及 Masson 染色，觀察病理改變，行肺泡炎及纖維化評分。

六、western blot檢測

-80℃冰箱取肺組織100 mg，加1 mL裂解液，制組織勻漿，高速離心30 min(10000 r/min)，取上清，BCA法蛋白定量。制備電泳凝膠，每孔蛋白上樣量約40 μg，電泳分離樣本，濕法轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1h；孵一抗(4℃過夜)，洗膜；孵二抗(2h)，洗膜，ECL法顯色，軟件計算蛋白相對表達量。

七、肺組織中Hyp含量測定

-80℃冰箱取肺組織80 mg，按說明書堿水法測定。

八、Elisa法測血清TNF-α、TGF-β1、IL-6：取血3 mL，4℃離心15 min(5000 r/min)，取上清1 mL，按試劑盒說明書操作，酶標儀檢測450 nm處的吸光度值。

九、統(tǒng)計方法

結(jié) 果

一、肺ECM水凝膠能均勻地附著在大鼠肺泡表面

新鮮肺組織顏色紅白相間，制成肺ECM 后，肉眼見肺臟變透明，HE染色未見細胞核成分(見圖1)。酶消化后制成水凝膠，注射入大鼠肺組織，免疫熒光顯示其能均勻分布于大鼠肺泡內(nèi)(見圖2)。

圖1 a：肺組織脫細胞前；b：肺組織脫細胞后；c：脫細胞肺組織HE染色(×200)

圖2 肺ECM水凝膠在大鼠肺組織的分布(×200)

二、肺ECM水凝膠能減輕肺組織水腫及炎癥反應

在造模后第16周，各組間差異有統(tǒng)計學意義(F=32.574，P<0.001)；與control組比較，IR+NS組及IR+ECM組大鼠肺系數(shù)均增高，與IR+NS組比較，IR+ECM組大鼠肺系數(shù)減小(P<0.05)(見表1)。

表1 3組大鼠肺系數(shù)的比較

在照射后第16周，HE染色顯示：Control組大鼠，肺泡結(jié)構(gòu)正常， IR+NS組大鼠肺泡間隔明顯變厚，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞，局部區(qū)域均勻紅染。IR+ECM組大鼠上述病理改變減輕。三組大鼠肺泡炎評分比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義(F=17.432，P<0.001)，與IR+NS組比較，IR+ECM組大鼠肺泡炎評分減小(P=0.040)(見圖3A、3C)。Masson染色顯示： Control組大鼠肺組織中無明顯膠原纖維沉積， IR+NS組大鼠肺組織中可見彌漫性膠原纖維聚集，IR+ECM組大鼠肺組織中藍染區(qū)域明顯減少，纖維化評分較IR+NS組下降，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義(F=41.061，P<0.001)(見圖3B、3D)。

圖3 病理染色及評分：A：HE染色(×200)；B：Masson染色(×100)；C：肺泡炎評分；D：膠原評分；與control組比，*P<0.05；與IR+NS組比， #P<0.05

三、肺ECM水凝膠能減輕大鼠全身炎癥反應

建模后第16周，各組間血清TNF-α、IL-6及TGF-β1水平差異有統(tǒng)計學意義(FTNF-α=21.092、PTNF-α<0.001；FIL-6=36.711、PIL-6<0.001；FTGF-β1=41.431、PTGF-β1<0.001)，與Control組比較，IR+NS組與IR+ECM組大鼠血清TNF-α、IL-6、TGF-β1均升高，與IR+NS組比較，IR+ECM組血清TNF-α、IL-6、TGF-β1水平下降，(P<0.05)(見表2)。

表2 血清IL-6、TNF-α、TGF-β1表達

四、肺ECM水凝膠抑制放射誘導的TGF-β1、smad3、p-smad3、α-SMA蛋白表達

在照射后第16周，各組間肺組織中TGF-β1、smad3、p-smad3、α-SMA蛋白水平差異有統(tǒng)計學意義(FTGF-β1=19.037、PTGF-β1<0.001；Fsmad3=32.029、Psmad3<0.001；Fp-smad3=33.038、Pp-smad3<0.001；Fα-SMA=33.848、Pα-SMA<0.001)，與Control組相比，IR+NS組與IR+ECM組大鼠肺組織中TGF-β1、smad3、p-smad3、α-SMA蛋白表達增加，與IR+NS組比較，IR+ECM組上述蛋白表達均有下降，(P<0.05)(見圖4)。

圖4 三組大鼠肺組織中TGF-β1/Smad3信號通路表達水平：*P<0.05 versus control group; **P<0.05 versus IR+NS group

五、肺ECM水凝膠能減輕放射誘導的Hyp表達

照射后第16周，各組間肺組織Hyp含量差異有統(tǒng)計學意義(F=49.971，P<0.001)，與Control組比較，IR+NS組與IR+ECM組大鼠肺組織中Hyp含量增加，與IR+NS組比較，IR+ECM組大鼠肺組織中Hyp含量下降，(P<0.05)(見圖5)。

圖5 Hyp的含量：與control組比，*P<0.05；與IR+NS組比， #P<0.05

討 論

放射性肺纖維化演變過程復雜，TGF-β1在其中占據(jù)著“閥門”地位，它能誘導PDGF、TNF-α、IL-6、IL-13等多種細胞因子合成及釋放，還能通過增加smad3磷酸化，促進下游促纖維化基因表達[11]。ECM支架材料具有良好組織相容性及多種生物學功效。真皮來源的水凝膠已用于創(chuàng)傷愈合、改善局部纖維化等[12-13]。本研究結(jié)果顯示：氣管內(nèi)注射肺ECM水凝膠后，放射性肺纖維化大鼠肺組織病理學改善，纖維化程度減輕，證實了肺ECM水凝膠具有抗放射性肺纖維化的功效。

TNF-α能調(diào)節(jié)成纖維細胞的增殖活化及細胞外基質(zhì)成分，抑制TNF-α表達可減輕博來霉素誘導的肺纖維化[14-15]。IL-6是常見炎性因子，研究顯示：肺纖維化大鼠血清中IL-6水平顯著升高，降低IL-6水平可以改善IPF癥狀[16]。TGF-β1異常升高可以促進TNF-α、IL-6的釋放，Chen等在研究EP對RILI作用中觀察到：照射后第4周、第20周，小鼠血清中TGF-β1水平均顯著高于對照組，抑制TGF-β1表達后，早期炎癥反應及后期纖維化均有緩解[17]。TGF-β1主要通過促進smad3磷酸化,發(fā)揮促纖維化作用[18]。研究報道：輻射后的肺組織中smad3、smad2 mRNA及蛋白表達升高，smad7基因表達下降，甘草次酸干預后，smad3、smad2基因表達受抑制、smad7基因表達增強，肺纖維化改善[19]。而smad3基因敲除的小鼠對前列腺素誘導的心室重構(gòu)、輻射誘導的肺纖維化抵抗性增強[20-21]。α-SMA是成纖維細胞活化的標志性蛋白，其過度表達，使得組織過度收縮、最終纖維化，其表達受smad3調(diào)控，余洪剛用TGF-β1干預成纖維細胞后觀察到：細胞中α-SMA的mRNA及蛋白表達均顯著增加，進一步在小鼠肺纖維化模型中發(fā)現(xiàn)：模型小鼠肺組織中Smad3、Snail、α-SMA蛋白表達上升，膠原沉積增多，通過復明湯灌胃后，上述蛋白表達得到抑制，肺纖維化程度得到改善[22]。本研究顯示：在照射后第16周，血清TGF-β1、TNF-α、IL-6水平明顯升高，肺組織中smad3、p-smad3蛋白表達增加，伴隨著肺組織纖維化形成，而經(jīng)肺ECM水凝膠干預后，血清中炎性因子水平下降，肺組織中smad3、p-smad3表達水平下降，Masson染色顯示纖維化程度減輕。羥脯氨酸在膠原蛋白中特異性表達，因此可以通過檢測肺組織中羥脯氨酸含量評估纖維化程度。本實驗結(jié)果顯示：氣管內(nèi)注射肺ECM水凝膠，可以顯著抑制放射性肺損傷大鼠肺組織中α-SMA蛋白表達以及羥脯氨酸生成，從而發(fā)揮抗纖維化作用。

綜上所述，本實驗結(jié)果顯示：肺ECM水凝膠能改善大鼠放射性肺纖維化，這可能是通過抑制TGF-β1/Smad3信號激活實現(xiàn)的。