王研，高思祺，匡倩瑤，劉怡寧，田燚

(大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023)

刺參Apostichopusjaponicus是中國北方的重要經(jīng)濟(jì)棘皮物種，具有較高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值。鹽度是影響刺參生理生態(tài)學(xué)的重要非生物因素，其變化對(duì)機(jī)體的生理過程具有重大影響[1]。目前，有關(guān)鹽度對(duì)刺參生理生態(tài)等影響的研究較多。王玉鳳等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽度為 25、27、29、31時(shí)，刺參的吞噬活力隨著鹽度升高而升高，當(dāng)鹽度升高至33時(shí)，吞噬活力隨之降低。趙斌等[3]研究發(fā)現(xiàn)，鹽度為31時(shí)，刺參的成活率最高且體長增長最大，當(dāng)鹽度升高至35、39時(shí)，成活率下降，當(dāng)鹽度降低至23、27時(shí)，體長顯著下降。袁秀堂等[4]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽度為31.5時(shí)，刺參的呼吸和排泄速率較低，而當(dāng)鹽度升高至36或降低至27、22時(shí)，呼吸和排泄速率則增加。王吉橋等[5]研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽度下降，刺參幼參體腔液中超氧化物歧化酶活力降低，溶菌酶活力升高。Geng等[6]研究發(fā)現(xiàn)，低鹽脅迫下在刺參的腸、肌肉和管足中皆可觀察到不同程度的損傷，其中，低鹽脅迫時(shí)的管足結(jié)締組織腫脹且縱向肌肉破裂，高鹽脅迫時(shí)結(jié)締組織收縮，與低鹽脅迫相比高鹽脅迫對(duì)刺參管足的影響更加顯著。這些結(jié)果表明，鹽度對(duì)刺參的存活、生長行為、能量代謝及組織學(xué)等都有著極大的影響。

microRNA(miRNA)是一類長度為18～22 nt且進(jìn)化相對(duì)保守的非編碼RNA，通過與靶基因特異性結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)。近年來，miRNA及其對(duì)應(yīng)的靶基因參與生物體環(huán)境脅迫響應(yīng)機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。將尼羅羅非魚暴露在不同鹽度水平下，其腎臟中miR-30c的相對(duì)表達(dá)量與鹽度存在負(fù)相向表達(dá)趨勢，當(dāng)miR-30c受到低鹽脅迫后，HSP70 mRNA的水平顯著提高，同時(shí)也影響魚體內(nèi)的離子濃度和血漿滲透壓[7]。三疣梭子蟹Portunustrituberculatus在4個(gè)鹽度水平脅迫下，鰓組織中有12個(gè)差異表達(dá)的miRNAs參與鹽度脅迫響應(yīng)[8]。太平洋牡蠣Crassostreagigas和香港牡蠣Crassostreahongkongensis在低鹽脅迫下，鰓組織中的miR-10a呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢，推測miRNAs可能在牡蠣的鹽度響應(yīng)中發(fā)揮重要功能[9]。鰻鱺Anguillajaponica鰓組織中的miR-122、miR-140-3p和miR-10b-5p在鹽度變化過程中參與其滲透調(diào)節(jié)過程，這3個(gè)miRNA在滲透調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮不同的作用[10]。尼羅羅非魚Oreochromisniloticus經(jīng)高鹽脅迫后，在鰓組織中抑制miR-429會(huì)影響羅非魚的滲透調(diào)節(jié)，并發(fā)現(xiàn)miR-429作為OSTF1表達(dá)的內(nèi)源性調(diào)控因子，參與尼羅羅非魚的滲透感應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)過程[11]。這些研究結(jié)果為水產(chǎn)生物響應(yīng)低鹽脅迫的分子機(jī)制提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，并為水產(chǎn)養(yǎng)殖中合理設(shè)定鹽度水平提供了理論參考。

miRNA通過與靶基因3′-非翻譯區(qū)(UTR)的堿基互補(bǔ)配對(duì)從而形成靶向RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，其中互補(bǔ)配對(duì)會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后靶基因的降解，并能有效調(diào)節(jié)外界環(huán)境中的不利因素。目前，有關(guān)miRNA及靶基因參與刺參的鹽度響應(yīng)研究相對(duì)較少。蔣亞男[12]對(duì)低鹽脅迫刺參進(jìn)行體內(nèi)和體外試驗(yàn)，驗(yàn)證了3個(gè)miRNA(miR-2008、miR-278-3p和miR-92a)與其靶基因在刺參鹽度適應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮的作用。郭然等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-22和miR-27及其靶基因在刺參的鹽度適應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制中也發(fā)揮作用。Tian等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-10通過靶向基因TBC1D5參與刺參的鹽度響應(yīng)過程。Huo等[15]發(fā)現(xiàn)，3個(gè)miR-1、miR-2和miR-3 在刺參鹽度脅迫中上調(diào)表達(dá)，這些結(jié)果為刺參其他miRNA調(diào)節(jié)鹽度響應(yīng)機(jī)制提供了重要信息。

本研究在課題組前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，測定了低鹽脅迫不同時(shí)間段后刺參體腔液中的離子濃度和鈉鉀ATP酶活力，通過對(duì)鹽度脅迫后的miRNA和靶基因的測序結(jié)果進(jìn)行分析，選擇與鹽度脅迫相關(guān)的3個(gè)差異表達(dá)的miRNA(miR-2011、miR-2010和miR-124)進(jìn)行研究，并獲得與其互作的靶基因，探究了其在刺參鹽度響應(yīng)中的表達(dá)情況，以期為了解刺參鹽度響應(yīng)機(jī)制提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用刺參取自河北唐山市海域，試驗(yàn)前期暫養(yǎng)于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖水槽，暫養(yǎng)7 d左右，期間保證24 h充足氧氣，每天投食、吸底一次，并用自然海水與曝氣自來水混合配制低鹽海水(鹽度18)，連續(xù)3 d測量鹽度，使海水鹽度穩(wěn)定。

選擇狀態(tài)良好、體質(zhì)量為(16.38±1.27)g的刺參進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以低鹽脅迫0 h 作為對(duì)照組，脅迫6、24、48 h 作為試驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭刺參，于脅迫不同時(shí)間點(diǎn)，用一次性針頭吸取刺參體腔液，將體腔液以3 000 r/min離心5 min，棄上清液獲得體腔細(xì)胞，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 低鹽脅迫下相關(guān)離子濃度及鈉鉀ATP酶活力的測定 在低鹽脅迫的0、6、24、48 h取刺參體腔液，用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定刺參體腔液中的鈉、氯、鉀離子濃度，以及鈉鉀ATP酶活力。

1)鈉離子濃度。鈉離子與6-氫氧化銻鉀在分散劑和除干擾劑的存在下形成均一的濁度。在620～630 nm 波長測定其吸光度值，并計(jì)算樣本中鈉離子濃度(mmol/L)。

鈉離子濃度=(樣本OD值/標(biāo)準(zhǔn)OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(140 mmol/L)×樣品稀釋倍數(shù)。

2)氯離子濃度。氯離子與硫氰酸汞會(huì)形成有色的絡(luò)合物，絡(luò)合物顏色的深度與氯離子的濃度成正比。在480 nm 處測定其吸光度值，并計(jì)算氯離子濃度(mmol/L)。

氯離子濃度=(樣本OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(20 mmol/L)×樣品稀釋倍數(shù)。

3)鉀離子濃度。先將樣本用蛋白沉淀劑處理，而樣本中的鉀離子與NA-TPB產(chǎn)生混濁且穩(wěn)定的懸浮液，鉀離子的濃度與混濁度成正比。在440 nm處測定其吸光度，并計(jì)算樣本中鉀離子濃度(mmol/L)。

鉀離子濃度=(樣本OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.4 mmol/L)×樣品稀釋倍數(shù)。

4)鈉鉀ATP酶活力。ATP經(jīng)過ATP酶的催化分解可產(chǎn)生ADP和無機(jī)磷，再通過測定無機(jī)磷的含量判斷ATP酶活力的高低。在636 nm處測定各管吸光度值，并計(jì)算樣本中ATP酶活力(U/mg prot)。

ATPase活力=(樣本OD值-對(duì)照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.02 μmol/mL)×6×7.8/樣本蛋白濃度。

1.2.3 低鹽脅迫下滲透壓 利用Gonotec Osmomat 03冰點(diǎn)滲透壓儀對(duì)低鹽脅迫后的體腔液進(jìn)行測定，每個(gè)樣品測定3次，取其平均值。

1.2.4 差異表達(dá)miRNA的篩選及靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測與分析 基于鹽度脅迫后刺參轉(zhuǎn)錄組和miRNA的高通量測序結(jié)果，利用BLAST將刺參轉(zhuǎn)錄組的序列同miRNA數(shù)據(jù)庫中的miRNA進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)過程中設(shè)定miRNA序列與轉(zhuǎn)錄組序列錯(cuò)配不超過3。將成熟 miRNA序列比對(duì)到轉(zhuǎn)錄組序列上，在其位置上下游各取100個(gè)堿基作為可能的miRNA前體，設(shè)置前體最短為55 nt。將獲得的miRNA前體序列同蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，將比對(duì)到蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列去掉，經(jīng)過篩選得到的序列用RNAfold軟件預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu)，最后根據(jù)比對(duì)的位置得到最終成熟的miRNA。

經(jīng)過上述比對(duì)預(yù)測與分析，從刺參低鹽脅迫后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫表達(dá)譜中篩選獲得miR-2011、miR-2010和miR-124這3個(gè)miRNA。利用WebLOGO(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)對(duì)miRNAs前體序列和成熟體序列的堿基保守性進(jìn)行分析。

利用miRanda 3.01 軟件進(jìn)行3個(gè)miRNA靶基因的預(yù)測。檢測分?jǐn)?shù)(單殘基對(duì)分?jǐn)?shù))S>90且最小自由能低于-17 kcal/mol 的候選目標(biāo)作為首選的靶基因，最終選擇得分較高、熱力學(xué)穩(wěn)定性較強(qiáng)的基因作為候選基因。針對(duì)3個(gè)miRNA進(jìn)行了前體序列分析，并從miRNA Base中選擇海膽Lytechinusvariegatus、紅鰭東方鲀Takifugurubripes、鯉Cyprinuscarpio、斑馬魚Daniorerio、蝠海星Patiriaminiata、黑青斑河鲀Tetraodonnigroviridis和柯瓦列夫斯基橡膠蟲Saccoglossuskowalevskii進(jìn)行分析，獲得miRNA的進(jìn)化關(guān)系。

1.2.5 總RNA 提取及mRNA反轉(zhuǎn)錄 收集體腔細(xì)胞離心后加入1 mL Trizol，室溫放置15 min，加入200 μL氯仿，震蕩后放置15 min，以12 000 r/min離心15 min，吸取上清液放入另一離心管中；加入0.5 mL異丙醇混勻后放置5～10 min，相同轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄上清液，加入1 mL乙醇，震蕩懸浮，以8 000g離心5 min，棄上清液，室溫晾干5～10 min，加入適量的H2O。mRNA反轉(zhuǎn)錄體系(20 μL)：RNA 100 ng，oligo(Dt)181 μL，Dntp Mixture 0.5 μL，RNase Inbibitor(40 U/μL)0.25 μL，RTase M-MLV(200 U/μL)0.25 μL，用無RNase-free ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：42 ℃下變性退火30 min，95 ℃下酶失活5 min。

1.2.6 miRNA cDNA合成 cDNA合成反應(yīng)體系(20 μL)：RNA 2 000 ng，2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL，miRNA RT Enzyme Mix 2 μL，用無 RNase ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：42 ℃下退火延伸 60 min，95 ℃下酶失活 3 min后反應(yīng)終止。

1.2.7 miRNA的表達(dá)量分析 利用軟件Primer 3.0軟件在線設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)行引物特異性檢測。試驗(yàn)所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。3個(gè)miRNA及內(nèi)參基因引物序列見表1。試驗(yàn)miRNA qPCR的反應(yīng)體系：2×miRcute Plus miRNA Premix(含 SYBR 和ROX)10 μL，F(xiàn)orward primers 0.2 μL(表 1)，Reverse primer(100 mmol/L)0.2 μL，50×ROX Reference Dye 0.2 μL，無RNase ddH2O 7.6 μL。qPCR反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性10 min；95 ℃下循環(huán)變性15 s，60 ℃下退火復(fù)性60 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。采用 2-△△Ct方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用T檢驗(yàn)法進(jìn)行組間比較，顯著性水平設(shè)為0.05，極顯著性水平設(shè)為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 低鹽脅迫后離子濃度、滲透壓及鈉鉀ATP酶活力的變化

從表2可見：刺參體腔液中的鈉離子濃度在低鹽度(18)脅迫6、24 h時(shí)均顯著高于對(duì)照組(0 h)(P<0.05)，且在6 h 時(shí)最高，而在48 h與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)；氯離子、鉀離子濃度在整個(gè)低鹽脅迫期間均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，且在 6 h 時(shí)出現(xiàn)最低濃度；鈉鉀ATP酶活力在低鹽脅迫 6 h 時(shí)開始顯著降低(P<0.05)，在 24 h 時(shí)出現(xiàn)最低值；滲透壓在低脅迫后極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，且在24 h 時(shí)達(dá)到最低值。

表2 不同脅迫時(shí)間下刺參體腔液中離子濃度、滲透壓和鈉鉀ATP酶活力的變化

2.2 3個(gè)差異表達(dá)miRNA的前體序列分析

基于測序結(jié)果比較分析后，獲得差異表達(dá)的3個(gè)miRNA(miR-2011、miR-124和 miR-2010)，其前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)如圖1所示，miR-2011、miR-124和 miR-2010均能形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。其中，miR-2011屬于MIPF00007家族，預(yù)測其前體長度為100 nt，前體的最小自由能為-219.95 kJ/mol;miR-124 屬于MIPF0000021家族，預(yù)測其前體長度為101 nt，最小自由能為-144.47 kJ/mol;miR-2010屬于MIPF0002019家族，預(yù)測其前體長度為79 nt，最小自由能為-139.16 kJ/mol。

圖1 miRNA前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)

3個(gè)miRNA的前體序列與其他物種的聚類分析結(jié)果如圖2所示,刺參的miR-124、miR-2011和miR-2010分別與海膽的miR-124、miR-2011和miR-2010的前體序列親緣關(guān)系較近，在進(jìn)化樹中歸屬于同一支。

圖2 miRNA前體序列結(jié)構(gòu)進(jìn)化樹

將miR-124的前體序列和成熟體分別與其對(duì)應(yīng)家族的其他物種進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果如圖3所示。從圖3A可見：miR-124的前體序列中有33個(gè)堿基相同，存在兩個(gè)重疊區(qū)，可見miR-124家族成員在進(jìn)化過程中可能存在高度保守區(qū)，這個(gè)高度保守區(qū)域在26～44堿基位點(diǎn)，另一個(gè)在58～76堿基位點(diǎn)；miR-124的前體序列中也存在諸多不保守區(qū)域，這些不保守區(qū)域可能是在形成的過程中其前體長期自然選擇導(dǎo)致了突變的積累并固定的結(jié)果。從圖3B可見，miR-124的成熟序列中也有保守堿基和存在差異的堿基。從圖3C、D可見，miR-2011的前體序列和成熟序列中也有保守堿基和存在差異的堿基。從圖3E、F可見，miR-2010的前體序列中存在不一致的堿基，而miR-2010的成熟序列的堿基基本一致。

圖3 miR-124、miR-2011和miR-2010與其他物種序列的比對(duì)

2.3 3個(gè)miRNA靶基因預(yù)測結(jié)果

利用miRanda 3.01 軟件進(jìn)行靶基因的預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-124的2～19位點(diǎn)與EGF3基因的496～517堿基位點(diǎn)能夠結(jié)合，序列比對(duì)分值為145，高于閾值參數(shù)90，最小自由能為-79.50 kJ/mol，說明miR-124與靶基因EGF3結(jié)合能力強(qiáng)，預(yù)測的靶基因EGF3可靠。miR-124的種子區(qū)與IMPA1基因的454～474 位點(diǎn)特異性結(jié)合，序列比對(duì)分值為142，最小自由能為-71.13 kJ/mol，說明IMPA1也是miR-124的靶基因。PPM1L基因3′-UTR 區(qū)域序列與miR-2010、miR-2011種子區(qū)堿基均能匹配，序列比對(duì)得分和最小自由能分別為153、-83.26 kJ/mol和149、-84.94 kJ/mol，預(yù)測結(jié)果說明，PPM1L基因?yàn)閙iR-2010和miR-2011的共有靶基因。miR-2011的2～21位點(diǎn)與靶基因PBK的655～676位點(diǎn)序列比對(duì)分值為164，最小自由能為-88.28 kJ/mol，預(yù)測結(jié)果說明，PBK基因?yàn)閙iR-2011的另一個(gè)靶基因(圖4)。

圖4 miRNA與靶基因的結(jié)合靶點(diǎn)

2.4 差異表達(dá)的3個(gè)miRNA的驗(yàn)證

在差異表達(dá)的miRNA中選擇3個(gè)miRNA進(jìn)行分析，測序結(jié)果顯示，miR-124和miR-2010在鹽度脅迫中下調(diào)表達(dá)，而miR-2011在鹽度脅迫中上調(diào)表達(dá)(表3)。定量PCR驗(yàn)證3個(gè)miRNA在刺參鹽度脅迫下的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-2010和miR-2011的表達(dá)情況與測序結(jié)果一致，而miR-124的表達(dá)與測序結(jié)果存在差異(圖5)。

表3 低鹽脅迫下試驗(yàn)組與對(duì)照組差異表達(dá)的miRNA調(diào)節(jié)情況

圖5 miR-2011、miR-2010和miR-124 RNA的測序與定量表達(dá)比較

2.5 3個(gè)miRNA在鹽度脅迫下的表達(dá)變化

從圖6可見：低鹽脅迫下，miR-124的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢，24 h時(shí)其表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，且表達(dá)量是對(duì)照組的3.4倍，在48 h時(shí)表達(dá)量逐漸下降并與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)；miR-2011表達(dá)量在各個(gè)脅迫時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的上調(diào)，脅迫24、48 h時(shí)其表達(dá)量與對(duì)照組有極顯著性差異(P<0.01)，且表達(dá)量分別為對(duì)照組的14倍和80倍；miR-2010表達(dá)量在鹽度脅迫過程中呈上調(diào)表達(dá)，脅迫48 h時(shí)達(dá)到最大值，除脅迫6 h外，其余時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)量均與對(duì)照組均有極顯著性差異(P<0.01)。

*表示與對(duì)照組(0 h)有顯著性差異(P<0.05)；**表示與對(duì)照組有極顯著性差異(P<0.01)。

3 討論

3.1 低鹽脅迫下離子濃度、滲透壓及酶活力變化

研究表明，刺參經(jīng)過鹽度脅迫后體內(nèi)的鈉、鉀、氯離子濃度、滲透壓及鈉鉀ATP酶活力均會(huì)隨之發(fā)生變化[16]。本試驗(yàn)中，鈉離子濃度在鹽度脅迫后6 h時(shí)最高，而氯離子和鉀離子濃度在此時(shí)則最低，鈉鉀ATP酶也在6 h時(shí)開始變化并在24 h時(shí)出現(xiàn)最低值，滲透壓在24 h時(shí)達(dá)到最低值?；诒驹囼?yàn)結(jié)果推斷，6～24 h可能是刺參鹽度響應(yīng)的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。前期研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，刺參在6 h時(shí)為其鹽度變化的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致[6]。王茂林等[17]研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，鈉鉀ATP酶在24 h后趨于穩(wěn)定，認(rèn)為刺參可能已適應(yīng)了鹽度脅迫的環(huán)境。本研究結(jié)果為后期試驗(yàn)提供了基礎(chǔ)，為了更好地了解刺參的鹽度響應(yīng)過程，可以選取6、24 h作為鹽度響應(yīng)的重要時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

3.2 刺參3個(gè)miRNA的序列分析

miRNA通過堿基互補(bǔ)原則切割靶基因mRNA、介導(dǎo)DNA甲基化、抑制翻譯等方式在生物生長發(fā)育中起著調(diào)控功能[18]，通過miRNA的序列分析能夠說明其進(jìn)化特性，進(jìn)而在一定程度上有助于對(duì)miRNA功能的理解。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，miRNA的生物信息學(xué)分析及序列特征取得了一定的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)miRNA家族序列在發(fā)育過程中呈現(xiàn)出保守性的特點(diǎn)。如let-7、miR-4和miR-60 等在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物間高度保守，這說明它們可能識(shí)別多個(gè)位點(diǎn)或靶標(biāo)，在不同生物中發(fā)揮相同或相似的作用[19-20]。miR-183基因簇作為在感覺器官組織中特異性表達(dá)的基因簇高度保守，對(duì)感覺器官的發(fā)育和功能具有重要作用[21-24]。在文昌魚的研究中，通過對(duì)miR-216家族的進(jìn)化特性分析也發(fā)現(xiàn)，miR-216家族均具有較高的保守性[25]。本試驗(yàn)中，miR-2010的成熟序列中存在較多的保守區(qū)，miR-124家族成員也在26～44、58～76堿基位點(diǎn)有兩個(gè)保守區(qū)域，這說明miR-2010家族在生物進(jìn)化過程中高度保守(圖3)。這種序列的高度保守性，推測可能是與物種進(jìn)化過程中生物體基本的共同功能有關(guān)。高度的保守性被認(rèn)為與其功能的重要性有著密切關(guān)系，同時(shí)也為生物早期進(jìn)化的同源性提供了某種證據(jù)[26-28]。目前，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的miRNA家族中，miRNA前體序列中和成熟序列中均存在序列的差異。本研究中，miR-124和miR-2011的前體序列中存在諸多變異的區(qū)域，且不同miRNA家族中其序列的保守程度存在不一致(圖3)。研究認(rèn)為，這可能是與物種在長期自然選擇中出現(xiàn)基因缺失或基因的插入突變等有關(guān)，也可能與物種在某些方面的特異性或者特殊功能有關(guān)[29]。

3.3 3個(gè)miRNA在刺參鹽度響應(yīng)過程的表達(dá)分析

研究表明，miRNAs 在介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[30]。如刺參的miR-10在低鹽脅迫后被誘導(dǎo)表達(dá)，并通過靶向基因TBC1D5參與鹽度響應(yīng)過程[14]。在斑馬魚中miR-8通過靶向基因nherf1進(jìn)而調(diào)節(jié)Na+/H+交換器的作用，參與斑馬魚的滲透調(diào)節(jié)過程[31]。在鰻鱺中，miR-122、miR-140-3p和miR-10b-5p在鹽度脅迫后均被誘導(dǎo)表達(dá)，并參與其鹽度響應(yīng)過程[10]。在羅非魚中，miR-429作為OSTF1的調(diào)節(jié)因子直接調(diào)節(jié)OSTF1的表達(dá)，在羅非魚的滲透調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[11]。本研究中，miR-124、miR-2011和miR-2010在鹽度脅迫后均被誘導(dǎo)表達(dá)(圖6)，說明這3個(gè)miRNA可能參與了刺參的鹽度響應(yīng)過程。隨脅迫時(shí)間的延長，miR-124表達(dá)量先升高后降低，而miR-2011、miR-2010表達(dá)量在脅迫各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有所上調(diào)，這3個(gè)miRNA的不同表達(dá)模式，可能說明在鹽度響應(yīng)過程中，需要3個(gè)miRNA不同的表達(dá)豐度來適應(yīng)鹽度脅迫的變化。具體的協(xié)同作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的試驗(yàn)來驗(yàn)證。

3個(gè)miRNA預(yù)測獲得的靶基因PPM1L是錳離子、鎂離子依賴的絲氨酸、蘇氨酸蛋白磷酸酶，這些基因在物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、生物合成等一系列生理功能中發(fā)揮重要功能。這些靶基因與3個(gè)miRNA間在鹽度脅迫響應(yīng)中的互作關(guān)系是下一步研究的重點(diǎn)，需要更多的試驗(yàn)來驗(yàn)證其在刺參鹽度響應(yīng)機(jī)制中的作用。

4 結(jié)論

1)低鹽脅迫下刺參體腔液中的離子濃度均發(fā)生變化，鉀及氯離子濃度呈先下降后趨于穩(wěn)定，而鈉離子濃度呈先上升后下降的趨勢，鉀ATP酶活力均下降，說明刺參可能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的離子濃度來應(yīng)對(duì)外界環(huán)境中鹽度的變化。

2)在miR-124、miR-2011和miR-2010的前體序列結(jié)構(gòu)進(jìn)化中，海參和海膽在進(jìn)化樹上位于同一分支，說明其序列相對(duì)保守。

3)通過預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，miR-124與EGF3、IMPA1能夠結(jié)合，miR-2011與PPM1L、PBK有靶向位點(diǎn)，miR-2010與PPM1L能夠結(jié)合，說明miR-124、miR-2011和miR-2010轉(zhuǎn)錄后可能通過調(diào)節(jié)靶基因EGF3、IMPA1、PPM1L、PBK的表達(dá)，從而參與刺參鹽度脅迫響應(yīng)過程。