謝 敏，張 靜，王夢(mèng)芝，周瑤敏，張大文，費(fèi) 丹，趙立軍*，徐 俊*

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330200；2.四川省飼料工作總站，四川成都 610041；3.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

苜蓿因富含蛋白質(zhì)和能量，素有“牧草之王”的美譽(yù)，是草食動(dòng)物優(yōu)質(zhì)的飼草來源。在苜蓿種植過程中，病蟲害較多，如褐斑病、銹病、花葉病、霜霉?。幌x害多達(dá)10余種，包括蚜蟲、草地螟、薊馬等（周春雷，2008；魯鴻佩等，2008）。目前病蟲害防治仍以噴施高效氯氰菊酯、吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲嗪等農(nóng)藥為主（劉霞等，2019）。苜蓿每年收割2～5茬，有些種植戶為預(yù)防病蟲害的發(fā)生，常常加大農(nóng)藥劑量和噴施頻率，進(jìn)而導(dǎo)致苜蓿中農(nóng)藥殘留問題。與此同時(shí)，苜蓿等牧草通過根系吸收土壤中累積的農(nóng)藥也會(huì)造成農(nóng)藥殘留，通過飼喂進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，且因牛、羊等反芻動(dòng)物牧草攝入量大，更易造成體內(nèi)農(nóng)藥的慢性蓄積，導(dǎo)致動(dòng)物組織和奶產(chǎn)品中出現(xiàn)農(nóng)藥殘留，其中一些是國(guó)家違禁藥物成分，會(huì)對(duì)人體健康造成危害。再加上我國(guó)每年進(jìn)口苜蓿量很大，其質(zhì)量安全在一定程度上影響我國(guó)畜產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

盡管目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的報(bào)道較多（Lee等，2020；Viera等，2017；王峰恩等，2017），但針對(duì)牧草中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的研究較少，已有報(bào)道要么數(shù)量較少（谷旭等，2021）要么種類單一（孫婷婷等，2021），難以滿足現(xiàn)有檢測(cè)需求。因此，進(jìn)一步研究牧草中多種農(nóng)藥殘留精準(zhǔn)分析方法意義重大。當(dāng)前，農(nóng)藥殘留檢測(cè)主要有液相色譜-質(zhì)譜法（Chen等，2019）和氣相色譜-質(zhì)譜法（孫婷婷等，2021），而液相色譜-質(zhì)譜法因其靈敏度高、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為農(nóng)藥殘留檢測(cè)分析領(lǐng)域的主要方法。鑒于此，本研究以苜蓿為代表，通過乙腈提取，QuEchERS法凈化，C18色譜柱分離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定，建立了牧草中22種農(nóng)藥殘留的分析方法，以期為牧草質(zhì)量安全監(jiān)管及其農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為牧草的進(jìn)出口檢測(cè)提供了一種準(zhǔn)確的定量分析方法。

1 試驗(yàn)方法

1.1 儀器和試劑 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；N-EVAP112 氮吹儀；GL-88B型旋渦混合器。

甲胺磷、氧樂果、滅多威、噻蟲嗪、3-羥基克百威、多菌靈、樂果、啶蟲脒、磷銨、氯蟲苯、烯酰嗎啉、滅線磷、馬拉硫磷、三唑磷、氯唑磷、苯醚甲環(huán)唑、氟蟲腈砜、蠅毒磷、甲基異柳磷、水胺硫磷、甲拌磷、丙溴磷標(biāo)準(zhǔn)品；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅烷（C18）、硫酸鎂（MgSO4）、石墨化炭黑（GCB），試劑和溶劑均為分析試劑級(jí)或高效液相色譜級(jí)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取上述22種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈分別配置成1000.0 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液，然后用乙腈分別稀釋成質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的單標(biāo)中間液，再用乙腈稀釋制備成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中各農(nóng)藥質(zhì)量濃度為1.0 mg/L，-20℃下避光儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 UPLC-MS/MS條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm×1.8μm，美國(guó) Agilent公司）；流動(dòng)相：A為5 mmol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：35℃；梯度洗脫程序?yàn)椋?～4 min，B由2%線性變至80%；4～6 min，B由80%線性變至98%；6～8 min，B保持98%；8～9 min，B返回初始2%。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電離模式：電噴霧電離正負(fù)離子模式（ESI+和ESI-）；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；毛細(xì)管電壓：3000 V；離子源溫度：150℃；干燥氣溫度：150℃；干燥氣流量：15 L/min；霧化氣壓力：30 psi；鞘氣溫度：300℃；鞘氣流量：12 L/min；噴嘴電壓：500 V（ESI+）和1000 V（ESI-）。各農(nóng)藥其他質(zhì)譜參數(shù)見表 1。

表1 22種農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)

1.4 樣品制備 樣品切成1 cm長(zhǎng)，冷凍干燥研磨成粉，干燥器封存。

1.5 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取1.00 g苜蓿樣品于50 mL離心管中，加入10 mL飽和氯化鈉溶液浸泡10 min，渦旋1 min。再加入20 mL乙腈，渦旋 1 min，超 聲 15 min，4000 r/min 離 心 5 min，取5 mL上清液轉(zhuǎn)移至盛有300 mg無水MgSO4、100 mg PSA、100 mg C18和 5 mg GCB 吸附劑的15 mL離心管中，渦旋 1 min，4000 r/min 下離心5 min。取1 mL上清液，加入1 mL純水，渦旋混勻，過0.22μm水相微孔濾膜，待檢。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法優(yōu)化

2.1.1 提取劑選擇 苜蓿干燥后含水量較低，提取前加水可加大樣品分散度，增加比表面積，提升溶劑與樣品接觸面積，提取效果更佳（Lehotay等，2010）。且使用飽和氯化鈉更有利于水與提取劑分層。因此，本方法選擇在加提取溶劑前先加入飽和氯化鈉溶液浸泡。

由圖1可知，乙腈和1%乙酸乙腈效果最好，22種農(nóng)藥回收率均在65%～120%之間，其他2種提取溶劑效果不佳?？紤]到含1%乙酸乙腈溶液會(huì)導(dǎo)致部分堿性農(nóng)藥分解，于是選擇乙腈作為最終提取溶劑。

圖1 不同溶劑提取回收率

2.1.2 凈化方法優(yōu)化 參考農(nóng)藥殘留檢測(cè)常用的 QuEChERS方法（Chen等，2019）、Florisil PR（王帥等，2021）和活性炭固相萃取柱（趙阿璇等，2021）等對(duì)苜蓿樣品進(jìn)行凈化，結(jié)果如圖2。

由圖2可知，QuEChERS的綜合回收率和提取效果較好，除3-羥基克百威、多菌靈、樂果、啶蟲脒、磷銨的回收率超過120%，其他17種農(nóng)藥回收率范圍均在80%～120%之間。

圖2 不同凈化方法回收率

2.2 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限和定量限 采用純?nèi)軇┖蛙俎；|(zhì)分別配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以二者斜率計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（ME），發(fā)現(xiàn)22種農(nóng)藥均存在基質(zhì)效應(yīng)，除樂果基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)外（402%），其余均存在基質(zhì)抑制效應(yīng)（-10%～-71%）。因此，試驗(yàn)采用空白樣品溶液配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制作工作曲線降低了基質(zhì)干擾。

采用空白基質(zhì)加標(biāo)配制質(zhì)量溶度為0.5、1、2、5、10、20μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度 - 峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，22種農(nóng)藥線性良好，R2均大于0.994。將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至信噪比（S/N）為3和10的溶度分別定為化合物的檢出限和定量限，結(jié)果如表2，22種農(nóng)藥的LODs為0.01～0.2μg/kg，LOQs為0.02～0.5μg/kg，符合多種農(nóng)藥殘留分析要求。

2.3 回收率和精密度 采用空白樣品中添加低、中、高3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），其結(jié)果如表2。方法回收率為73.7%～107.1%，RSD為0.7%～9.8%，滿足農(nóng)藥的殘留檢測(cè)要求。谷旭等（2021）采用QuEChERS前處理結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)了苜蓿中樂果和甲基異柳磷等15種農(nóng)藥殘留，回收率為76.7%～118.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.9%～19.3%。張立田等（2019）采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定青貯玉米中滅多威和3-羥基克百威等8種氨基甲酯類農(nóng)藥殘留，回收率為70.83%～86.67%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0%～8.15%。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果相吻合，但本文檢測(cè)的農(nóng)藥種類更多、靈敏度和精密度更高，是牧草農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的補(bǔ)充，在滿足牧草樣品檢測(cè)要求的基礎(chǔ)上具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

表2 基質(zhì)效應(yīng)，檢出限和定量限及不同添加濃度的回收率和精密度（n=6）

3 結(jié)論

采用UPLC-MS/MS方法建立了同時(shí)檢測(cè)牧草樣品中22種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法。該方法前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)限和定量限更低，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，能滿足牧草樣品中農(nóng)藥殘留分析要求。