劉曉藝 金 琴 王可品 賴良學**

（1）中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣州 510530；2）三亞豬種質(zhì)資源創(chuàng)新研究院，三亞 572000；3）海南省實驗動物研究中心，三亞 572000）

家豬（Sus scrofa domesticus），不僅在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的經(jīng)濟價值，也是生物學領域不可或缺的大動物模型以及潛在的異種器官移植供體來源。

動物模型是研究人類基因功能、疾病發(fā)展機理及開發(fā)新治療手段的重要工具，在生命科學研究的發(fā)展過程中，小鼠是應用最為廣泛的哺乳動物模型。但小鼠并不適合所有生命科學研究，在腫瘤模型的檢測中常用的X光、超聲檢查，受限于小鼠的體型難以應用；在腫瘤藥物試驗中，約95%在小鼠上有非常明顯作用的藥物，在臨床療效甚微，甚至無效［1］；在基因功能的研究中，有些基因突變可導致人出現(xiàn)嚴重的疾病癥狀［2］，但在小鼠上表型不明顯，甚至沒有表型［3］。具有傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值的豬，在生物醫(yī)藥領域，由于其體型、解剖結(jié)構(gòu)、器官大小、生理代謝、免疫系統(tǒng)都與人類更加相似，使其在異種器官移植［4］、疾病模型［5］、腦科學［6］、生物反應器［7］、代謝模型［8］上的研究發(fā)展迅速。2012 年完成了豬的全基因組測序，發(fā)現(xiàn)豬全基因組與人有很大的相似性，不僅有112個位點的氨基酸序列完全相同，并且這些位點中大部分異常都會導致人相應的疾?。?］。此外，在蛋白質(zhì)表達類型上，與小鼠相比，豬與人有更多的相似性，例如人胰腺α和β細胞表達MAF亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄 因 子B （MAF bZIP transcription factor B，MAFB），豬也表達，而小鼠卻不表達［10］。憑借以上優(yōu)勢，豬不僅非常適合作為由于基因突變導致的人類疾病的動物模型［11-12］，在異種器官移植領域也具有潛在的應用前景。2022 年1 月10 日，世界首例成功植入基因編輯豬心臟的手術完成，并延長了患者2個月的壽命，開辟了基因編輯豬在異種器官移植領域的新時代［13］。

基因修飾通常是在基因組中插入或刪除某些基因，從而獲得理想的表型特征。在技術層面，基因修飾豬最開始主要依賴顯微注射來獲得，通過將多拷貝的DNA 注入到受精卵的核中，至少有一個拷貝的DNA 整合到受精卵的基因組中，才能成功獲得轉(zhuǎn)基因豬［14］。而后，隨著體細胞核移植技術（somatic cell nuclear transfer，SCNT）的興起，可以將發(fā)生了基因修飾的體細胞核移植到去核的卵母細胞中，再移植到代孕動物的輸卵管中，分娩后即可獲得基因修飾動物［15］，顯著提高了培育基因修飾豬的效率。其中，獲得基因修飾體細胞是該技術關鍵環(huán)節(jié)之一，早期主要依賴轉(zhuǎn)基因和自然發(fā)生的低概率同源重組［16］分別建立轉(zhuǎn)基因細胞系和基因打靶細胞系，但由于體細胞在體外的增殖能力有限，基因修飾效率極低；隨著慢病毒轉(zhuǎn)染［17］、轉(zhuǎn)座子［18］、RNA 干擾［19］、位點特異性重組酶［20］的出現(xiàn)，在一定程度上提高了獲得基因修飾細胞的效率；直到ZFN［21］、TALEN［22］、CRISPR/Cas9［23］等人工核酸酶的出現(xiàn)，基因編輯領域發(fā)生了革命性的變化，這些核酸酶不僅能在基因組特定位置切割，極大地提高了同源重組的頻率和精確性，還將基因編輯的類型從敲除和敲入拓展到無痕編輯、多基因同時突變、條件性基因編輯（圖1）。

Fig.1 Schematic of the methods on generating genetically modified pigs圖1 制備基因修飾豬的方法示意圖

上述技術的發(fā)展使研究人員能夠高效快速地制備表達外源基因或敲除內(nèi)源基因的基因修飾豬模型。然而，在生命體生長發(fā)育過程中，有相當一部分基因只在特定時期或特定組織中起功能，還有一部分基因敲除致死［24］。此外，即使是廣泛表達的基因，根據(jù)研究目的，也需要在特定時期調(diào)控其表達。因此，為了更加全面深入地研究基因的功能，條件性基因修飾系統(tǒng)應運而生。

條件性基因修飾系統(tǒng)在小鼠［25］、果蠅［26］、斑馬魚［27］等模式動物中發(fā)展成熟且應用廣泛，尤其是小鼠胚胎干細胞體系非常成熟，使小鼠成為條件性基因修飾系統(tǒng)首選的哺乳動物模型。然而，部分小鼠基因的表達位置與時間和人存在差異，導致基因突變小鼠無法模擬人出現(xiàn)的表型。人類亨廷頓舞蹈癥是由于HTT基因1 號外顯子CAG 重復導致蛋白質(zhì)錯誤折疊和聚集，在基因修飾豬上出現(xiàn)了與人類似的神經(jīng)退行性特征［28］，在小鼠模型上則沒有明顯癥狀［29］；cftr基因突變小鼠肺部沒有明顯病理變化［30］，但CFTR突變的豬出現(xiàn)了典型的肺部缺陷［31］?；蛐揎椮i是不可或缺的動物疾病模型。由于很多致病基因直接敲除致死，因此構(gòu)建能在特定時間、特定空間調(diào)控基因表達的基因修飾豬模型，將為研究人類基因功能、疾病發(fā)展機理及開發(fā)新的治療手段提供更加理想的大動物模型。

條件性基因修飾是相對于直接基因修飾的一個概念，本文按照條件性基因修飾導致的結(jié)果以及研究中的主要應用，簡單地將其分為條件性基因缺失系統(tǒng)和條件性基因過表達系統(tǒng)。

1 條件性基因缺失系統(tǒng)

1.1 Cre/loxP系統(tǒng)

自1998 年冷泉港會議上宣布“Cre works.”，Cre/loxP重組酶系統(tǒng)成為基因功能研究中廣泛應用的工具。其不僅能實現(xiàn)基因的刪除、倒置，更重要的是突破了時間和空間的限制，加速了基因功能研究與基因修飾動物模型的建立［32］。 Cre（cyclization recombinase）重組酶來源于P1噬菌體，屬于酪氨酸位點特異性重組酶的整合酶家族［33］，能夠特異性識別兩個長度為34 bp的DNA序列并介導兩個位點之間的序列重組，被識別的特異性序列稱為loxP（locus of x-over，P1），這34 bp的序列中包含8 bp 的核心序列以及兩側(cè)倒置和回文13 bp，單個Cre重組酶分子與loxP位點每個回文的一半結(jié)合，形成四聚體，使兩個loxP位點結(jié)合在一起，目的基因兩側(cè)插有兩個同向的loxP，通過在特定時期給予Cre，就能實現(xiàn)特定階段目的基因的精確刪除［34］；當目的基因兩側(cè)插有兩個反向的loxP，Cre能夠介導二者之間基因的倒置。此外，將Cre置于組織特異性啟動子下，待基因開始表達可實現(xiàn)Cre的組織特異性表達，進而實現(xiàn)特定組織中目的基因特異性敲除，為研究早期胚胎發(fā)育中的重要基因尤其是一些致死基因提供了可能。小鼠憑借成熟的體外胚胎干細胞培養(yǎng)體系，已經(jīng)產(chǎn)生多種Cre/loxP的品系［35-37］。在小鼠上利用Cre/loxP通過控制不同時間節(jié)點的敲除來研究基因功能時，需要將目的基因兩側(cè)插有l(wèi)oxP位點的DNA注入小鼠的胚胎干細胞，通過控制其后代與能表達Cre的小鼠交配時間即可實現(xiàn)時間性特異敲除；當需要在特定組織或器官中特異性敲除目的基因時，只需要將控制Cre表達的組成型啟動子換成組織特異性啟動子，就能獲得特定組織器官敲除目的基因的小鼠。然而，條件性基因敲除小鼠的制備路線在豬上很難實現(xiàn)。首先，豬沒有成熟的體外胚胎干細胞培養(yǎng)體系，無法通過向胚胎干細胞注射DNA 制作嵌合體來獲得后代，其次豬的妊娠期大約114 d，周期相對較長，成本高昂，此外有研究發(fā)現(xiàn)Cre對于豬早期胚胎發(fā)育有一定的毒性［38］，因此，利用Cre/loxP 制備條件性基因敲除豬非常困難（圖2）。

Fig.2 Principles of Cre/loxP system and application in gene-editing pigs圖2 Cre/loxP條件性系統(tǒng)原理圖及在基因修飾豬中應用

目前鮮有先通過制備目的基因兩側(cè)含有l(wèi)oxP位點的基因修飾豬，再通過與表達Cre的轉(zhuǎn)基因豬交配來獲得條件性基因修飾豬模型的報道。作為經(jīng)典且應用廣泛的條件性基因修飾系統(tǒng)，研究人員探索了在豬上應用Cre/loxP系統(tǒng)的可能。在豬上應用Cre/loxP 的前提是驗證Cre 在轉(zhuǎn)基因豬體內(nèi)的活性及功能。2009 年，Li 等［39］通過構(gòu)建loxP-stoploxP-CMV-EGFP 的豬成纖維細胞系并利用體細胞核移植技術獲得了Cre功能驗證的報告豬品系，利用表達Cre的腺病毒感染報告豬成纖維細胞后表達綠色熒光證明了Cre在轉(zhuǎn)基因動物中的活性。2010年，Chen等［40］通過控制給poly I/C的劑量和時間，來啟動Mx1，構(gòu)建Mx1特異性啟動Cre表達的基因修飾豬，推動了以豬為模型研究發(fā)育和疾病機制的發(fā)展。TP53抑癌基因突變在臨床腫瘤患者中占比很高，為了更好地研究TP53在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的機制，迫切需要建立TP53突變的大動物模型。2012 年，Leuchs 等［41］構(gòu)建了Cre 介導重組后失活TP53和表達人TP53R175H同源的TP53R167H突變的基因修飾豬，很好地模擬Li Fraumeni 綜合癥和人群中偶發(fā)的TP53特定突變導致的癌癥，TP53基因修飾豬的出現(xiàn)促進了以大動物為模型研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展。2014 年，Li 等［42］借助TALEN 首次在豬的開放性位點Rosa26進行打靶，敲入了Cre介導表達的報告基因EGFP，并且通過盒式置換實現(xiàn)綠色熒光變紅色熒光，同樣利用盒式置換可以實現(xiàn)任意基因的異位過表達獲得多種轉(zhuǎn)基因豬，不僅為研究大動物譜系示蹤提供了重要工具豬模型，也為家畜育種提供了一種新的思路。

上述關于在豬上應用Cre/loxP的研究，為了避開通過交配傳遞Cre的時間成本，大都利用病毒傳遞Cre。為了降低實驗成本，規(guī)避早期Cre 表達帶來的毒性，研究人員嘗試在豬體內(nèi)實現(xiàn)Cre的條件性表達，例如利用Tamxifen 與雌激素受體結(jié)合的特性［43-44］，將Cre和表達含有突變配體結(jié)合的雌激素受體基因放在同一個啟動子下，翻譯出來的Cre-ETR2 融合蛋白與細胞質(zhì)中的熱休克蛋白HSP90 形成復合物，只有外源藥物Tamxifen 存在時，才能破壞二者的結(jié)合，形成的Cre-ER-T2復合物進入細胞核識別loxP 位點，介導目的基因的刪除、倒置，形成了受外源藥物誘導的Cre-ERT2系統(tǒng)［45］，降低了實驗成本。

上述研究表明，Cre 在成體豬體內(nèi)有活性并且可以發(fā)揮功能，并且在豬上可以利用Cre/loxP系統(tǒng)來實現(xiàn)單一基因的條件性表達，如果同時條件性刪除幾個基因，一種方法是可以通過對豬體細胞進行多輪編輯，使其成為含有多個目的基因兩側(cè)插有l(wèi)oxP位點的細胞，再通過體細胞核移植技術獲得成體。然而，一方面多個基因同時編輯效率及其低下，另一方面由于豬的體細胞增殖能力有限，難以承受多輪編輯和篩選。另一種方法需要分別制備不同的基因修飾豬品系，通過多次交配來獲得含有多個位點插有l(wèi)oxP的基因修飾豬，但是由于豬的繁殖周期長，多次交配耗時費力也不一定能獲得目的基因修飾豬（圖3）。2017 年，本課題組Wang 等［46］利用TALEN 在豬胎兒成纖維細胞進行編輯，在Rosa26位點利用同源重組敲入了SA-loxP-NEOPolyA-loxP2272-PolyA-tdTomato-2A-SpCas9-loxPloxP2272。當Cre 存在時，方向相反的loxP 對發(fā)生兩次置換，最后在Rosa26位點只留下不成對的SAloxP-SpCas9-T2A-tdTomato-PolyA-loxP2272，通過SCNT成功獲得了Cre介導表達SpCas9的基因修飾豬，不僅在細胞水平驗證了轉(zhuǎn)基因的SpCas9 活性和功能，還通過滴鼻慢病毒傳遞Cre 和gRNA，成功制備了第一只條件性、原發(fā)性肺癌豬模型，加速了利用大動物模型開展癌癥診療、藥物篩選、臨床研究的進程。

Fig.3 Combination Cre/loxP with Flp/FRT to eliminate resistance markers圖3 Cre/loxP與Flp/FRT聯(lián)合應用去除抗性標記

1.2 Flp/FRT系統(tǒng)

Flp 整合酶來源于釀酒酵母，與Cre 同屬一個整合酶家族，有著與Cre 類似的DNA 序列識別和重組機制，F(xiàn)lp 識別的DNA 序列與Cre 識別的loxP序列結(jié)構(gòu)相同，也是兩側(cè)13 bp 的回文序列和8 bp的核心序列，但是具體的堿基組成不同，靶序列兩側(cè)FRT 的方向相同時介導靶序列的刪除，方向相反時介導靶序列倒置［47-48］。最開始發(fā)現(xiàn)Flp發(fā)揮作用的最適溫度是30℃，在一定程度上限制了其在動物模型中的應用，后面經(jīng)過優(yōu)化后其最適溫度為37℃［49］。由于Cre/loxP 系統(tǒng)制備基因修飾動物效率高，應用成熟且廣泛，目前在基因修飾豬上，F(xiàn)lp/FRT能實現(xiàn)的，經(jīng)典的Cre/loxP系統(tǒng)都能實現(xiàn)，因此很少有單獨應用Flp/FRT建立的基因修飾豬報道，但是在篩選基因修飾細胞時，常常與Cre/loxP系統(tǒng)聯(lián)用，在獲得陽性細胞后刪除抗性篩選標記，提高了基因修飾動物的安全性（圖3）。2021 年，本課題組聯(lián)用Cre/loxP 和Flp/FRT，創(chuàng)建出精巧的條件性基因表達關-開-關轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，將此系統(tǒng)插入到靶基因的編碼外顯子中，在Cre介導下，插在倒置的轉(zhuǎn)錄終止序列兩側(cè)的反向loxP 對發(fā)生置換，倒置的轉(zhuǎn)錄終止序列正置，靶基因表達關閉；然后在Flp 介導下，兩側(cè)loxP 外圍同向的Frt 對發(fā)生刪除，轉(zhuǎn)錄終止序列被刪除，靶基因恢復表達，從而實現(xiàn)了基因表達的可逆調(diào)控。這兩種重組酶系統(tǒng)的聯(lián)用應用到研究腫瘤、發(fā)育等相關基因的功能，將更加全面的闡釋基因功能，促進靶向藥物研發(fā)，加速臨床轉(zhuǎn)化（相關結(jié)果投稿中）。

2 條件性基因過表達系統(tǒng)

2.1 組織特異性啟動子驅(qū)動系統(tǒng)

TALEN、ZFN、Cas9 等核酸酶出現(xiàn)之前，自然發(fā)生DNA 雙鏈斷裂和定點敲入的效率極低，為了在豬上實現(xiàn)組織特異性基因表達，通常采用的技術路線是將組織特異性表達基因的啟動子利用PCR 技術擴增下來和需要表達的外源基因放在一起，或者人工設計啟動子來實現(xiàn)組織特異性外源基因的表達。核酸酶出現(xiàn)之后，不僅大大提高了DNA 雙鏈斷裂發(fā)生的概率，而且還能實現(xiàn)定點基因敲入。利用人工核酸酶實現(xiàn)組織特異性表達，只需要打靶組織特異性表達基因的終止密碼子附近，使其發(fā)生DNA 雙鏈斷裂，同時提供含有斷裂位點上下游同源臂、外源基因的同源重組模板，這樣就能真正實現(xiàn)內(nèi)源基因啟動子介導的外源基因過表達。2016 年，Lai 等［50］利 用CRISPR/Cas9 在 豬Oct4最后一個外顯子的終止密碼子進行打靶，同時提供含有5'同源臂、2A-Tdtomato 和3'同源臂的外源模板，利用同源重組成功獲得了紅色熒光指示Oct4表達的豬成纖維細胞，并通過SCNT獲得了健康的仔豬，實現(xiàn)了細胞多能性狀態(tài)的實時監(jiān)測。2021 年，Du 等［51］利用CRISPR/Cas9 在豬ACE2的內(nèi)源性啟動子到1號外顯子前進行打靶，同時提供含有5'同源臂-人ACE2-3'同源臂的外源模板，利用同源重組得到了表達人ACE2受體的豬成纖維細胞，并通過體細胞核移植技術成功獲得了基因修飾豬，為新型冠狀病毒檢測、治療、藥物研發(fā)提供了一種新的大動物模型。目前，大都采用CRISPR/Cas9 介導的定點同源重組來獲得基因修飾細胞，再通過體細胞核移植技術得到基因修飾豬的技術路線。

2.2 Tet-off/on調(diào)控系統(tǒng)

四環(huán)素（tetracyclines）與細菌30S核糖體亞基結(jié)合，是抑制細菌蛋白質(zhì)合成和生長的抗生素，在革蘭氏陰性菌的耐藥性研究中發(fā)現(xiàn)，膜蛋白TetA介導的四環(huán)素流出是造成耐藥的主要原因，而TetA 的表達受四環(huán)素反應抑制蛋白TetR 的調(diào)控，然而在Tn10編碼的Tet操縱子中，tetA和tetR基因的位置相反，它們的表達受同一調(diào)控區(qū)域但相互獨立的啟動子PA 和PR 調(diào)控，TetR 蛋白形成二聚體，識別和結(jié)合tetO元件，從而抑制PA和PR啟動子的活性，使tetA和tetR不表達［52-54］。1992年，Gossen等［55］描述了利用Tet操縱子的tetR和tetO的特性來開發(fā)哺乳動物細胞中控制基因表達的Tet-off調(diào)控機制：單純性皰疹病毒VP16蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域與tetR融合表達，使其成為受四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活因子（tTA），7 個tetO 融合進真核啟動子的TATA 盒；在沒有四環(huán)素時，TATA 盒與tetO 結(jié)合，激活下游基因表達；四環(huán)素存在時，tTA 中的tetR構(gòu)象改變，阻止tetO 結(jié)合，基因表達關閉［56-57］（圖4a）。利用這一系統(tǒng)研究目的基因功能時需要持續(xù)加藥，而激活基因表達時又需要完全移除四環(huán)素，雖然這在細胞水平很容易操作，但在成體動物實驗中難以控制，因此Tet-off系統(tǒng)不適合制備動物模型。

1995年，Gossen等［58］篩選到以相反方式發(fā)揮作用的rTetR，從而得到了四環(huán)素存在時，目的基因表達；撤藥后，基因表達逐漸關閉的Tet-on 系統(tǒng)，最初的Tet-on系統(tǒng)對四環(huán)素不敏感，需要較高劑量的誘導，通過不斷地突變篩選才得到正常劑量就能實現(xiàn)調(diào)控目的基因表達（圖4b）。2012 年，Klymiuk 等［59］首次將Tet-on 系統(tǒng)應用到大動物模型豬上，通過第一輪細胞篩選獲得了表達rtTA 的陽性克隆并獲得了基因修飾豬，分離出的細胞進行二次篩選，經(jīng)過兩輪篩選分別建立了受四環(huán)素誘導表達RANKL、CTLA-4Ig的基因修飾豬模型，解決了異種器官移植中組成型表達某些基因?qū)е鹿w過度免疫缺陷難以存活的情況，為異種器官移植和再生醫(yī)學中供體的基因修飾提供了一種新思路。2012年，Jiang等［60］通過慢病毒轉(zhuǎn)染Tet-on元件構(gòu)建了受四環(huán)素誘導穩(wěn)定表達豬生長激素蛋白的豬成纖維細胞系，與組成型表達生長激素的細胞系相比，pGH mRNA 水平提高了10 倍，利用該系統(tǒng)結(jié)合體細胞核移植技術對產(chǎn)生健康高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因豬具有重要指導意義。2014 年，Ruan 等［61］先獲得rtTA 置于豬內(nèi)皮細胞特異性啟動子Icam-2下游的細胞，在此細胞基礎上再轉(zhuǎn)染Tre 啟動pp65RHD-IRESEGFP 表達的質(zhì)粒，同樣經(jīng)過兩輪篩選獲得了條件性表達pp65RHD 的豬成纖維細胞系，解決了豬異種器官移植中內(nèi)皮細胞功能障礙的問題，進一步推動了條件性基因表達系統(tǒng)在異種器官移植領域的應用。同年，以Tet-on 為基礎，受四環(huán)素誘導表達EGFP的轉(zhuǎn)基因豬誕生［62］。2021年，本課題組借助Cpf1 分別在豬的開放性位點Rosa26和Hipp11定點敲 除rtTA 和Tre-attP-Tdtomato-attP 等Tet-on 系統(tǒng)的元件，并將篩選到的陽性細胞作為供體通過SCNT成功獲得受Dox誘導表達紅色熒光豬模型；在此基礎上，利用僅在Rosa26位點含有rtTA 元件的豬胎兒成纖維細胞再分別將原癌基因KRASG12D和基因編輯所需要的核酸酶Cas9 定點敲入Hipp11位點，通過SCNT 也分別獲得了Dox 誘導表達KRASG12D和Cas9的模型豬，并且在誘導KRASG12D表達后，模型豬上出現(xiàn)腫瘤表型［63］。

Fig.4 Schematic of inducible system Tet-off and Tet-on圖4 Tet/off與Tet/on可誘導系統(tǒng)原理圖

2.3 PhiC31調(diào)控系統(tǒng)

PhiC31 整合酶是一種位點特異性重組酶，來源于鏈霉菌屬噬菌體，屬于絲氨酸催化的重組酶家族，通過識別宿主基因組上兩個大約30 bp 的序列——attB 和attP，來介導兩個位點之間序列的精確整合，整合后產(chǎn)生兩個雜交位點，稱為attL 和attR，不能再被PhiC31 識別，因此PhiC31 介導的整合是單向的［64-66］（圖5）。相比較Cre 介導的整合，重組后識別位點仍然存在，可能會發(fā)生二次重組，因此PhiC31更適合基因整合，Cre更適合刪除基因。研究人員通過實驗發(fā)現(xiàn)，基因組上存在的天然attP與含有attB的質(zhì)粒組合PhiC31才能實現(xiàn)高效的重組整合；反之，基因組上的天然attB 與含有attP 質(zhì)粒組合，無法實現(xiàn)［67］。真核生物基因組中存在的天然attP序列稱為偽attP序列，通過在外源模板上人為添加attB，在PhiC31 的介導下就能實現(xiàn)精確地整合，因此PhiC31 整合酶系統(tǒng)成為轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的有力工具［68］。2013 年，Bi 等［69］首次在豬的PK15 細胞中應用這一系統(tǒng)，證明了豬基因組中天然存在的偽attP序列功能性，為定向豬基因組工程開辟了一條新途徑。2017 年，Park 等［70］首次利用顯微注射將Cas9 和靶向目的基因的sgRNA 注射到豬的受精卵中以獲得目的基因敲除的動物，此外他們還提供含有attP的外源模板，獲得COL1A位點含有attP 的轉(zhuǎn)基因動物，并在細胞水平驗證在給予含有attB-EGFP-PhiC31 的外源模板時，能實現(xiàn)EGFP 的位點特異性整合。2018 年，Nunes Dos Santos 等［71］利用Cas9 和靶向豬血栓調(diào)節(jié)蛋白（pTHBD）外顯子上下游的兩條sgRNA 刪除豬基因組上原有的pTHBD，同時提供含有sgRNA 切割位置同源臂、attP-hTHBD-attB、抗性篩選標記的外源模板，發(fā)生同源重組后的陽性細胞，在PhiC31、同源重組的介導下，在豬基因組上實現(xiàn)豬內(nèi)源性pTHBD 啟動子啟動人血栓調(diào)節(jié)蛋白的表達，由于豬血栓調(diào)節(jié)蛋白無法調(diào)節(jié)人的血栓凝結(jié)，這一研究結(jié)果將直接促進豬作為供體在異種器官移植領域的研究。此外，利用這一策略，可以高效快速構(gòu)建表達人基因的豬細胞系，相比較與病毒介導的隨機整合，PhiC31 整合酶系統(tǒng)精確度更高，對宿主也更安全，但目前在基因修飾豬中應用較少。

Fig.5 Gene recombination is mediated by PhiC31圖5 PhiC31介導基因重組

3 展望

在制備條件性基因修飾動物模型時有很多選擇，但研究表明并不是所有的系統(tǒng)都是完美的。例如，在利用Cre/loxP 或Flp/FRT 時有一個預先的假設是動物體內(nèi)不存在天然的loxP 位點，然而在研究中發(fā)現(xiàn)基因組中存在天然的偽序列［72-73］，這些偽序列在體外實驗中能夠在Cre 介導下發(fā)生重組，盡管小鼠上有大量的Cre/loxP品系沒有顯示出這一問題，但由于Cre/loxP基因修飾豬數(shù)量較少，難以統(tǒng)計。此外，通過組織特異性啟動子表達Cre 時，最常見的問題是啟動子不特異，造成Cre的泄漏表達，無法實現(xiàn)空間特異性表達。盡管可能存在一些問題，但是仍然是小鼠上主要應用的條件性系統(tǒng)，據(jù)此建立了多種小鼠品系。在豬上應用條件性系統(tǒng)時可以適當參考小鼠上選用的啟動子以及打靶外顯子位置來獲得高質(zhì)量受調(diào)控的條件性基因修飾豬。同樣的，Tet-on系統(tǒng)在實際動物模型中也存在一些問題。在構(gòu)建的Dox 誘導Cas9 表達的基因修飾豬模型中發(fā)現(xiàn)，即便是全身表達的啟動子，Cas9 在各個器官中的表達量也不盡相同。此外有研究發(fā)現(xiàn)，Tet-on中的rtTA元件能引起猴子中某些個體的免疫反應［74］，這一點在小鼠中未曾報道［75-76］，也提示大動物模型與嚙齒類動物之間的差異性。

在豬上應用條件性基因修飾系統(tǒng)，從最初只是在豬的基因組中放入單一條件性系統(tǒng)所需要的元件來研究特定基因的功能，發(fā)展到現(xiàn)在，不僅實現(xiàn)了多個條件性系統(tǒng)聯(lián)用來調(diào)控基因表達“關-開-關”，而且將條件性系統(tǒng)與人工核酸酶聯(lián)用，獲得了條件性表達人工核酸酶的工具豬。為了構(gòu)建一個適用于多種基因編輯場景的工具豬模型，本實驗室利用人工核酸酶Cpf1 介導的雙鏈斷裂，成功將rtTA 和Tre3G-SpCas9-2A-tdTomato分別與豬基因組上的兩個開放性位點Rosa26和Hipp11同源重組，利用體細胞核移植技術，成功獲得了受四環(huán)素誘導的穩(wěn)定表達SpCas9 并且能穩(wěn)定遺傳的基因修飾豬品系。通過飼料添加及腹腔注射四環(huán)素，不僅實現(xiàn)了Cas9 在多個器官中的穩(wěn)定高效表達，還在細胞水平驗證了受四環(huán)素調(diào)控的Cas9活性和功能；此外，通過向該基因修飾豬傳遞靶向抑癌基因TP53、LKB1敲除的sgRNA和過表達原癌基因KRASG12D的腺相關病毒，成功獲得了轉(zhuǎn)移性胰腺癌豬模型。更重要的是，在此模型豬細胞的基礎上，僅需要一步基因修飾引入靶向不同基因的sgRNA，就能實現(xiàn)任一基因和多基因的組織特異性敲除，直擊Cre/loxP系統(tǒng)在大動物模型應用中的痛點，建立一套更適用于大動物的模型的時空調(diào)控系統(tǒng)，將極大地促進豬作為一種大動物模型在再生醫(yī)學、臨床醫(yī)學、腫瘤學中的應用，同時也為非人靈長類等大動物模型條件性系統(tǒng)的建立提示了一種新的路線（相關結(jié)果在投稿中）。

除了研究基因功能、建立基因突變驅(qū)動的疾病模型，條件性基因修飾系統(tǒng)在豬的異種器官移植領域也能解決直接敲除導致的供體豬過度免疫缺陷難以存活的問題，促進異種器官移植領域的發(fā)展。盡管人工核酸酶的發(fā)展極大地提高了獲得含有條件性基因修飾元件的豬體細胞，但目前，哺乳動物克隆胚胎早期發(fā)育仍存在很多缺陷，結(jié)合表觀遺傳修飾敲除XIST 的體細胞通過SCNT 獲得轉(zhuǎn)基因動物的出生率也只有1%～2%［77］，這些都制約著基因修飾動物的制備。因此，條件性基因修飾豬的制備目的不能只局限在研究單一基因功能，而是要致力于建立適用多種基因編輯的通用性工具豬，充分發(fā)揮每一頭基因修飾豬的應用價值，真正實現(xiàn)一豬多能、一豬多用（圖6）?；蛐揎椮i將憑借其與人類更多的相似性、飼養(yǎng)成本相對較低，成為臨床前優(yōu)于嚙齒類動物、廉于非人靈長類的、不可或缺的高性價比大動物模型。

Fig.6 Application of conditional gene modification in pigs圖6 條件性基因修飾豬的應用