王新輝

（華北制藥股份有限公司 倍達(dá)分廠，河北 石家莊 052165）

0 引言

頭孢氨芐為第一代半合成頭孢菌素，該藥為口服制劑，是一種早期常見的抗生素，能抑制細(xì)胞壁的合成，主要用于敏感菌所致的呼吸道感染、尿路感染、皮膚軟組織感染等的治療。

研究證明，高分子雜質(zhì)是β-內(nèi)酰胺類抗生素的過敏源之一，β-內(nèi)酰胺類抗生素單體分子在特定條件下能聚合形成高分子聚合物，而這些藥物的過敏反應(yīng)發(fā)生率與高分子聚合物的含量成正相關(guān)系，而非β-內(nèi)酰胺類抗生素本身。因此對高分子聚合物的分析是質(zhì)量控制的關(guān)鍵。

針對目前華北制藥股份有限公司頭孢氨芐聚合物原檢測方法中主峰與其前相鄰雜質(zhì)峰不能做到基線分離，影響檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的情況，對其檢驗(yàn)方法中的條件進(jìn)行優(yōu)化并驗(yàn)證，通過方法的優(yōu)化，為檢測頭孢氨芐聚合物的準(zhǔn)確性提供可靠的依據(jù)。

1 檢測方法

色譜條件：用TSK-GELG2000SWXL色譜柱，以[0.005 mol/LNaH2PO4溶 液-0.005 mol/LNa2HPO4溶液（39∶61） ]-乙腈（95∶5） 為流動相；流速為0.6 mL/min；檢測波長為220 nm。

系統(tǒng)適用性要求供試品溶液色譜圖中，頭孢氨芐峰與相鄰雜質(zhì)峰間的分離度應(yīng)＞1.5。

2 檢測方法優(yōu)化

2.1 流動相中有機(jī)相的比例優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

系統(tǒng)適用性溶液：取供試品溶液適量70 ℃水浴加熱30 min。

2.1.1 流動相配制

分別選用磷酸鹽緩沖液｛0.005 mol/L 磷酸氫二鈉溶液-0.005 mol/L 磷酸二氫鈉（61∶39）｝，與乙腈按不同比例（100∶0、95∶5、90∶10、85∶15）混合。

2.1.2 試驗(yàn)過程

取系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)樣。

2.1.3 圖譜

不同強(qiáng)溶劑比例條件下的系統(tǒng)適用性色譜圖如圖1 所示。

圖1 不同強(qiáng)溶劑比例條件下的系統(tǒng)適用性色譜Fig.1 Chrogram of system opplicability under different strong solvent ratio

2.1.4 試驗(yàn)結(jié)果

隨著有機(jī)相濃度的提高，主峰與前相鄰峰的分離效果變差并且沒有達(dá)到基線分離，100%濃度緩沖鹽中主峰與前相鄰峰之間疑似還有未完全分離的峰，而磷酸鹽緩沖液∶乙腈=95∶5 的比例中主峰與前相鄰峰分離較好，因此選擇磷酸鹽緩沖液∶乙腈=95∶5 作為流動相。

2.2 流動相pH 值的優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 流動相配制

磷酸鹽緩沖液｛0.005 mol/L 磷酸氫二鈉溶液-0.005 mol/L 磷酸二氫鈉（61∶39）｝，磷酸鹽緩沖液∶乙腈=95∶5，用磷酸和氫氧化鈉調(diào)磷酸鹽緩沖鹽的pH 值為5.0、6.0、7.2、8.0。

2.2.2 試驗(yàn)過程

取系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)樣。

2.2.3 圖譜

不同緩沖液pH 值條件下的系統(tǒng)適用性色譜如圖2 所示。

圖2 不同緩沖液pH 值條件下的系統(tǒng)適用性色譜Fig.2 Chromatography of system applicability under different buffer pH value conditions

2.2.4 試驗(yàn)結(jié)果

頭孢氨芐主峰前雜質(zhì)峰與主峰的分離度隨著磷酸鹽緩沖鹽的pH 值的增大而逐漸變差，其中pH=6.0 的分離較好，因此選擇pH=6.0 的緩沖鹽作為流動相A。

2.3 流速的優(yōu)化

2.3.1 流動相配制

磷酸鹽緩沖液｛0.005 mol/L 磷酸氫二鈉溶液-0.005 mol/L 磷酸二氫鈉（61∶39）｝，磷酸鹽緩沖液∶乙腈=95∶5，pH=6.0，分別采用不同的流速為0.5、0.6、0.7 mL/min。

2.3.2 試驗(yàn)過程

取系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)樣。

2.3.3 圖譜

試驗(yàn)中不同流速條件下的系統(tǒng)適用性色譜如圖3 所示。

圖3 不同流速條件下的系統(tǒng)適用性色譜Fig.3 Chrogram of system applicability at different flow rates

2.3.4 試驗(yàn)結(jié)果

流速為0.5 mL/min 條件下的圖譜主峰與前雜質(zhì)峰的分離效果最佳。

2.4 不同濃度的磷酸鹽緩沖鹽優(yōu)化

2.4.1 流動相配制

試驗(yàn)分別選用濃度為0.0025、0.005、0.01、0.05 mol/L 的磷酸鹽緩沖液｛磷酸氫二鈉溶液-磷酸二氫鈉（61∶39）｝，磷酸鹽緩沖液與乙腈混合（95∶5）。

2.4.2 試驗(yàn)過程

取系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)樣。

2.4.3 圖譜

不同緩沖鹽濃度條件下的系統(tǒng)適用性色譜如圖4 所示。

圖4 不同緩沖鹽濃度條件下的系統(tǒng)適用性色譜Fig.4 Chrogram of systematic applicability under different buffer salt concentrations

2.4.4 試驗(yàn)結(jié)果

分別對不同濃度的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，0.0025 與0.005 mol/L 緩沖鹽濃度均可實(shí)現(xiàn)基線分離。因此，進(jìn)一步對0.0025 和0.005 mol/L 的緩沖鹽離子濃度進(jìn)行試驗(yàn)選擇。

2.5 篩 選

2.5.1 流動相配制

{磷酸氫二鈉溶液-磷酸二氫鈉（61∶39） 用磷酸調(diào)節(jié)pH=6.0｝：乙腈=95∶5,使用的磷酸鹽緩沖液濃度為0.0025、0.005 mol/L。

2.5.2 試驗(yàn)過程

取系統(tǒng)適用性溶液、對照品溶液進(jìn)樣。

2.5.3 圖譜

試驗(yàn)中不同濃度緩沖鹽的系統(tǒng)適用性色譜如圖5 所示。

圖5 不同濃度緩沖鹽的系統(tǒng)適用性色譜Fig.5 Chrogram of the systematic applicability of different concentrations of buffered salts

0.0025 mol/L 緩沖鹽∶乙腈=95∶5 對照品溶 液色譜如圖6 所示。

圖6 0.0025 mol/L 緩沖鹽∶乙腈=95∶5 對照品溶液色譜Fig.6 Chrogram of control solution of 0.0025 mol/L buffer salt∶acetonitrile=95∶5

0.005 mol/L 緩沖鹽∶乙腈=95∶5 對照品溶液 色譜如圖7 所示。

圖7 0.005 mol/L 緩沖鹽∶乙腈=95∶5 對照品溶液色譜Fig.7 Chrogram of control solution of 0.005 mol/L buffer salt∶acetonitrile=95∶5

2.5.4 試驗(yàn)結(jié)果

使用2 種不同緩沖鹽濃度（0.0025 和0.005 mol/L） 配制的流動相得到的系統(tǒng)適用性溶液圖譜的分離度均較好，主峰和主峰前雜質(zhì)峰均能實(shí)現(xiàn)基線分離，但在緩沖鹽濃度為0.0025 mol/L 的流動相系統(tǒng)下得到的對照品溶液圖譜中頭孢氨芐峰分叉，峰形異常。因此采用0.005 mol/L 的緩沖鹽濃度為最終使用的緩沖液。

3 方法確定與方法驗(yàn)證

3.1 方法確定

色譜條件：色譜柱：TSK-GELG2000SWXL；流動相的配置：以[0.005 mol/LNaH2PO4溶液-0.005 mol/LNa2HPO4溶液（39∶61） 用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至6.0]-乙腈（95∶5）。

流速：0.5 mL；

檢測波長：220 nm。

系統(tǒng)適用性要求系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中，頭孢氨芐峰與前相鄰雜質(zhì)峰間的分離度應(yīng)＞1.5。

3.2 分析方法驗(yàn)證

3.2.1 檢測限

配制低濃度的頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)溶液，調(diào)整此對照品溶液的濃度，以信噪比約3∶1 時的相應(yīng)濃度作為檢測限。

經(jīng)測試，溶液濃度為0.0514 μg/mL 時，信噪比為3.1∶1，此相應(yīng)濃度作為檢測限。

3.2.2 定量限

配制低濃度的頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)溶液，以信噪比約為10∶1 時的相應(yīng)濃度作為定量限。

經(jīng)測試，溶液濃度為0.182 μg/mL 時，信噪比為10.3∶1，此相應(yīng)濃度作為定量限。

3.2.3 線性范圍

配置不同濃度的頭孢氨芐溶液，在定量限濃度-200%濃度范圍內(nèi)配制6 個濃度的溶液，在測定條件下分別進(jìn)樣，根據(jù)測得的峰面積對應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸，頭孢氨芐線性方程：Y=52287138.9749x+302.2792；相關(guān)系數(shù)R 值為1.0000；在定量限濃度-200%濃度范圍內(nèi)頭孢氨芐濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.2.4 精密度

3.2.4.1 重復(fù)性

分別制備供試品溶液6 份注入液相色譜儀，記錄色譜圖；結(jié)果表明：6 份供試品溶液測得的各聚合物含量的RSD 值為5.12%，＜限度20%，說明方法精密度良好。

3.2.4.2 中間精密度

由不同分析人員，在不同儀器條件下進(jìn)行濃度測定，匯總2 組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，并對測定結(jié)果進(jìn)行評價。結(jié)果表明：聚合物含量12 個數(shù)據(jù)的RSD 為6.79%，均＜20%，說明該方法中間精密度良好。

3.2.5 耐用性

通過改變流速、柱溫、檢測波長、色譜柱來考察分析方法的耐用性。

供試品溶液在4 ℃條件下分別于0、4、8、12、16、20、24 h 按聚合物方法進(jìn)行檢測，考察溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：供試品溶液在4 ℃條件放置24 h，各時間點(diǎn)與0 h 聚合物含量的RD 最大為4.77%，＜10.0%，說明4 ℃條件下供試品溶液可放置24 h。

通過改變流速（0.6±0.1 mL/min）、柱溫（25±5 ℃）、波長（220 nm±5 nm）、調(diào)整流動相比例及更換不同的色譜柱來考察分析方法的耐用性，每個條件均制備2 份供試品溶液進(jìn)樣測定，同一變化條件下的6 個數(shù)據(jù)的RSD 值均＜20%，含量變化的絕對值在±0.1%，說明本方法測定頭孢氨芐聚合物耐用性良好。

4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)是在原檢測方法上對流動相中有機(jī)相的比例、流動相的pH 值、流速及不同濃度的緩沖鹽進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化后的檢測方法能夠做到基線分離，能較好地分離頭孢氨芐與其聚合物，并對確定好的優(yōu)化方法進(jìn)行了檢測限、定量限、線性范圍、精密度、耐用性的驗(yàn)證，方法重現(xiàn)好，且精密度、準(zhǔn)確度均能滿足質(zhì)量控制的要求，對頭孢氨芐中聚合物的測定不會產(chǎn)生結(jié)果偏差，為檢測頭孢氨芐聚合物的準(zhǔn)確性提供了可靠的依據(jù)。