段春宇

摘要： 為了探討酶聯(lián)免疫吸附法檢測飼料中黃曲霉毒素B1含量的可行性，試驗采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）比對免疫親和柱-高效液相色譜法（IAC-HPLC法），對飼料中黃曲霉毒素B1含量進行了檢測，對檢測結(jié)果的準確度、精密度和樣品加標回收率進行了分析。ELISA法線性方程相關(guān)系數(shù)為0.9952，相對標準偏差（RSD）為1.6%～8.1%，平均加標回收率為105.6%～111.8%。結(jié)果表明，ELISA法的準確性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好;且ELISA法檢測結(jié)果與IAC-HPLC法檢測結(jié)果的相對標準偏差（RSD）為5.4%～19.2%，兩種方法的檢測結(jié)果的偏差可以接受，表明ELISA法能滿足檢測需求。

關(guān)鍵詞：酶聯(lián)免疫吸附法;免疫親和柱-高效液相色譜法;飼料;黃曲霉毒素B1

黃曲霉毒素，是黃曲霉菌和寄生曲霉菌分泌的次級代謝產(chǎn)物，主要分為B、G類，其中黃曲霉毒素B1的含量最多，危害性最大，該毒素具有強致癌性、致畸性、致突變性。黃曲霉毒素B1可以侵害畜禽肝臟，導(dǎo)致肝臟變性、壞死等，進而導(dǎo)致畜禽肺臟、腎臟、脾臟、胃、直腸等器官發(fā)生病變;導(dǎo)致畜禽的免疫力降低;導(dǎo)致畜禽生長發(fā)育遲緩，采食量降低、食物利用率低;母畜不育或產(chǎn)仔少等問題。

黃曲霉毒素B1主要污染糧食作物及其副產(chǎn)品，其中，花生和玉米及其副產(chǎn)品污染最為嚴重，幾乎無法避免，該毒素性質(zhì)穩(wěn)定，持續(xù)高壓滅菌2h僅能降低其25%～33%的毒力，而且只有在282℃的高溫下才能被裂解，所以世界各國都嚴格設(shè)定“限量標準”。黃曲霉毒素B1污染飼料主要源于原料污染、儲存條件不當飼料霉變污染和加工過程污染。要預(yù)防黃曲霉毒素B1毒害畜禽，就要及時準確測定飼料原料及飼料成品中黃曲霉毒素B1含量，因而制定準確實用的檢測方案至關(guān)重要，進而加強原料的篩選、飼料的品控，更好的保護畜禽健康，發(fā)揮畜禽生產(chǎn)性能，將飼料價值充分發(fā)揮。

飼料中黃曲霉毒素B1的檢測方法較多，有薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析快速檢測試紙條等，本文采用免疫親和柱-高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測飼料原料和成品中黃曲霉毒素B1的含量，并通過比對分析，確定ELISA法檢測飼料中黃曲霉毒素B1含量的可行性。

2 免疫親和柱-高效液相色譜法材料與方法

2.1 試劑與耗材

甲醇（色譜純，默克公司）、黃曲霉毒素B1標準品（Sigma公司）、黃曲霉毒素免疫親和柱（ROMER公司）、氯化鈉（分析純）、玻璃纖維濾紙等。

2.2 主要儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀配熒光檢測器、光化學(xué)衍生器、高速萬能粉碎機、高速混勻器、固相萃取儀等。

2.3 方法

1）標準溶液的配制 黃曲霉毒素B1標準品（Sigma公司），原液濃度為20μg/mL，用甲醇溶液逐級稀釋成100ng/mL的工作液。再用流動相分別稀釋成0.10、0.50、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0ng/mL的標準工作液。

2）樣品前處理 試樣制備參照GB/T 20195—2006，用高速萬能粉碎機研磨后過1mm孔篩，混勻，儲存于封閉容器，避光低溫保存，待檢。稱取50.0g待檢樣品于250mL具塞錐形瓶中，加入5g氯化鈉和125.0mL的甲醇水（70+30）溶液混勻，振蕩器200rpm/min震蕩30min，定量濾紙過濾后，準確移取10.0mL濾液，加入20.0mL超純水稀釋混勻，玻璃纖維濾紙過濾，至濾液澄清，收集濾液于干凈離心管中做上樣液。

將免疫親和柱連接于10.0mL的玻璃定量管下，取15.0mL上樣液，過免疫親和柱，流速1～2drop/s;待柱內(nèi)液體排干后，分別兩次用10.0mL超純水清洗柱子，流速2～3drop/s;待柱內(nèi)液體全部排干后，增大泵壓，抽干免疫親和柱內(nèi)液體，用1.0mL甲醇洗脫柱子，流速自然重力，直至2～3mL空氣通過柱子，收集全部洗脫液于玻璃定量管中，加超純水定容為2.0mL。定容后的洗脫液用0.22μm的有機微孔過濾器過濾到樣品瓶中，待檢。

3）色譜條件 色譜柱：Agilent C18色譜柱（規(guī)格：150×4.6mm，粒度5μm）;流動相：超純水+甲醇+乙腈（60+20+20）等度洗脫;流速：1.0mL/min;FLD波長：激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長440nm;柱溫40℃;進樣量：50μL。

采用外標法，根據(jù)樣品峰保留時間進行定性，峰面積進行定量分析。

3 酶聯(lián)免疫吸附法材料與方法

3.1 試劑與耗材

黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒（ROMER公司）、超純水、針式過濾器。

3.2 主要儀器

酶標測定儀：內(nèi)置450nm濾光片、回旋振蕩器、渦旋振蕩器、微量移液器等。

3.3 方法

1）樣品前處理 稱取20.0g樣品于250mL具塞錐形瓶中，加入100.0mL甲醇水（70+30）溶液提取，置于回旋振蕩器上震蕩萃取3min，靜置樣品，定性濾紙過濾。用1mol/L的NaOH和HCl微調(diào)濾液pH 6～8，如果樣品酸性比較強，可以使用高濃度的酸堿進行調(diào)節(jié)，盡量減少酸堿的用量。用試劑盒提供分析緩沖液1：1稀釋濾液，于1mL離心管中，用渦旋振蕩器混勻，待測。

2）試劑盒操作過程 實驗室溫度控制在20～25℃，從冰箱中拿出試劑盒，取出試劑盒中所有試劑回溫2～3h;用八道移液器?。ňG色瓶蓋）酶聯(lián)偶合物200μL，放入綠色預(yù)混合板中;單道移液器分別取100μL各濃度標準品和樣品，放入以上預(yù)混合板中，用八道移液器混合四次（注意溶液不要溢出，防止各孔污染）;將孔板進行編號，以便記錄標準品、樣品位置，用八道移液器將上述混合液100μL轉(zhuǎn)移至抗體包被的孔中，室溫避光孵育15min，轉(zhuǎn)移過程中不要有氣泡;蒸餾水清洗4次拍干（清洗時各孔不要相互污染），用洗瓶沖洗時，不要直接沖洗孔，側(cè)著清洗，防止底部的物質(zhì)沖出，清洗后輕甩一下，在吸水紙上快速拍干孔板，不要大幅度用手甩板，孔板中沒有液滴即可;拍干后，用八道移液器每孔加入（藍色瓶蓋）底物100μL;室溫光孵育5min;時間到后，用八道移液器每孔加入（紅色瓶蓋）終止液100μL，輕輕搖勻后檢測;將孔板轉(zhuǎn)移到酶標儀450nm（帶630nm示差波長）讀取每孔的吸光度值。

4 結(jié)果與分析

4.1 結(jié)果

本研究選用空白玉米進行加標回收試驗，樣品名稱加標1、加標2和加標3，黃曲霉毒素B1添加濃度分別為10.0、20.0和50.0μg/kg，選取花生粕、玉米胚芽粕、奶牛配合飼料樣品各一個，分別用IAC-HPLC法和ELISA法各重復(fù)3次試驗。結(jié)果見表1。

1）免疫親和柱-高效液相色譜法的工作曲線、準確度、精密度 標準系列經(jīng)上機檢測，以測得峰面積為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，得到黃曲霉毒素B1標準品的峰面積（Y）的線性方程Y=10.00282X-1.71180，相關(guān)系數(shù)為0.99976，表明在0.10 ～50.0ng/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。加標回收試驗和重復(fù)性試驗是驗證方法準確度和精密度的重要手段。按上述IAC-HPLC法試驗方法，測試結(jié)果見表1。本結(jié)果的平均加標回收率為93.0%～99.0%，相對標準偏差（RSD）為0.8%～4.8%。說明此方法準確度高，穩(wěn)定性好。黃曲霉毒素B1的標準樣品色譜圖及待檢樣品色譜圖分別見圖1和圖2。

2）酶聯(lián)免疫吸附法的準確度、精密度 試劑盒標準系列經(jīng)上機檢測，在ROMER公司提供計算軟件上計算結(jié)果，線性方程相關(guān)系數(shù)為0.9952，表明在0.10 ～50.0ng/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。按上述ELISA法試驗方法，測試結(jié)果見表1。本結(jié)果的平均加標回收率為105.6%～111.8%，RSD為1.6%～8.1%。ELISA法的準確度高，穩(wěn)定性可以接受。ELISA法檢測結(jié)果與IAC-HPLC法檢測結(jié)果的RSD為5.4%～19.2%，兩種方法結(jié)果的偏差表明ELISA法準確度可以接受。

4.2 分析

使用IAC-HPLC法和ELISA法分別對飼料樣品進行檢測，通過表1數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，IAC-HPLC法測值均小于ELISA法，IAC-HPLC法前處理過程需要過免疫親和柱，在過柱過程中，黃曲霉毒素B1沒有全部收回，有微量損失，從而導(dǎo)致整體檢出率偏低。ELISA法檢測結(jié)果與IAC-HPLC法檢測結(jié)果的RSD為5.4%～19.2%，其中當樣品中黃曲霉毒素B1含量≥10μg/kg時，兩種方法結(jié)果的RSD為5.4%～9.0%，只有奶牛配合飼料黃曲霉毒素B1含量較低時，兩種方法結(jié)果的RSD值偏差較大，分析原因一是IAC-HPLC方法在過柱過程中，黃曲霉毒素B1有損失對檢測結(jié)果影響較大，二是ELISA法檢測低含量黃曲霉毒素B1時，存在假陽性的情況。而且隨著黃曲霉毒素B1濃度增加，兩種方法結(jié)果的重復(fù)性呈現(xiàn)良好趨勢。因此，ELISA法檢測飼料中黃曲霉毒素B1含量準確度較高，可以用于飼料中黃曲霉毒素B1批量檢測。

5 結(jié)論

綜上所述，ELISA法準確度高、穩(wěn)定性好，能夠滿足日常監(jiān)測的需求。與IAC-HPLC法相比，ELISA法不需要對樣品進行免疫親合柱過柱等復(fù)雜的前處理，且ELISA法可以同時檢測多個樣品，有效的提高了檢測效率，節(jié)省了檢測成本，可以作為日常批量監(jiān)測的首選方法。因IAC-HPLC法檢測結(jié)果可靠性強、可以有效避免樣品檢測的假陽性情況，因此，在實際檢測過程中可以采用ELISA法對大批量飼料樣品中黃曲霉毒素B1進行初篩快速測定，再采用IAC-HPLC法對疑似超標陽性樣品進行定量確認檢測。