張 權(quán)，劉利亞，周貽兵，吳玉田，李 磊，林 野，郭 華，周 雪，陳慶園*

（1.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

目前，我國竹木制品尚未納入生產(chǎn)許可管理產(chǎn)品類別，相關(guān)的技術(shù)規(guī)范、產(chǎn)品國家標(biāo)準(zhǔn)尚不完善?，F(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)僅包括GB/T 38742-2020《竹砧板》［9］、GB 19790.1-2021《一次性筷子第1部分：木筷》［10］和GB 19790.2-2005《一次性筷子第2 部分：竹筷》［11］，其余的竹木制品標(biāo)準(zhǔn)尚處于空白階段。多數(shù)竹木制品的理化檢測(cè)方法是參照GB 19790.2-2005，而該標(biāo)準(zhǔn)中只涉及噻苯咪唑、鄰苯基苯酚、聯(lián)苯、抑霉唑等化學(xué)指標(biāo)，未涵蓋五氯酚、苯甲醇、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、百菌清、對(duì)羥基苯基酸酯類等高效廣譜的防腐防霉劑。五氯酚及其鈉鹽是效果較佳、價(jià)格低廉的植物纖維防腐防霉劑［12］，通常竹木制品經(jīng)2%～5%五氯酚鈉溶液浸泡處理即可。其次，針對(duì)竹木制品的多種防腐防霉劑同時(shí)快速檢測(cè)的方法較少，方法靈敏度較低［13］。因此現(xiàn)階段的竹木產(chǎn)品缺乏快速有效的檢測(cè)監(jiān)控手段，因而建立一個(gè)準(zhǔn)確、快速、高效的測(cè)定竹木制品中多種防腐防霉劑的檢測(cè)方法具有重要意義。

本研究在參考《2018年國家食品污染和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》［14］的基礎(chǔ)上，針對(duì)濫用及非法添加的防腐防霉劑在竹木砧板分布不均勻、取樣缺乏代表性等問題，優(yōu)化樣本制備過程和前處理?xiàng)l件，利用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式對(duì)貴州省市售竹木砧板中的防霉防腐劑殘留水平進(jìn)行篩查和確證，發(fā)現(xiàn)其未知風(fēng)險(xiǎn)隱患，為今后竹木制品中防霉防腐劑的溯源分析、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及標(biāo)準(zhǔn)制定等方向提供了數(shù)據(jù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

布魯克Scion-TQ三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Bruker公司）；MilliQ去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）；HGC-36A氮吹儀（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）；安捷順電動(dòng)刨木機(jī)（捷順工具有限公司）。

苯甲酸、山梨酸（純度99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；2，4，6-三氯酚（1.01 mg/mL，中國計(jì)量科學(xué)研究院）；苯噻氰（100 μg/mL，北京曼哈格生物科技有限公司）；對(duì)羥基苯基酸甲酯、對(duì)羥基苯基酸丙酯、對(duì)羥基苯基酸丁酯（純度99.4%，美國AccuStandard公司）；抑霉唑、噻苯咪唑（100 μg/mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司）；鄰苯基苯酚（100 μg/mL，純度99.0%）、富馬酸二甲酯（純度99.7%）、苯甲醇（純度99.8%）、2，4，6-三溴酚（純度99.57%）、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯（純度98.79%）均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；戊唑醇、聯(lián)苯、克菌丹、林丹、百菌清、五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所）；三氯乙酸（純度99.7%，北京百靈威科技有限公司）；乙酸乙酯（HPLC級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙腈、正己烷（色譜純，默克有限公司）；醋酸酐（分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司）；SLC固相萃取柱（500 mg/6 mL，杭州福?？萍挤?wù)有限公司）；竹木砧板、一次性筷子為貴州省2020年食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)樣品，均購于超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：分別吸取不同體積的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液后混合，用丙酮定容至刻度即得，其中聯(lián)苯、鄰苯基苯酚的質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL，富馬酸二甲酯、2，4，6-三氯酚、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、百菌清為0.5 μg/mL，苯甲酸、山梨酸、苯甲醇、對(duì)羥基苯基酸甲酯為2.5 μg/mL，對(duì)羥基苯基酸丙酯、對(duì)羥基苯基酸丁酯、林丹、噻苯咪唑、抑霉唑、戊唑醇、苯噻氰、五氯酚、克菌丹為5.0 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)使用液于4 ℃冷藏保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備取砧板，板下放錫箔紙，用電刨在砧板表層從左至右依次刨削，砧板表層深度2 ～3 mm，要全部覆蓋砧板表層（雙面），收集所有木屑于錫箔紙上，用粉碎機(jī)低轉(zhuǎn)速粉碎均勻后，裝入聚乙烯塑料袋中。試樣量不少于20 g，貼好試樣編號(hào)，室溫下干燥處保存，備用。

1.2.2 樣品前處理稱取2.00 g試樣放入50 mL塑料離心管內(nèi)，加入10 mL水，60 ℃超聲提取10 min，再加入5 mL 5%三氯乙酸溶液，進(jìn)一步超聲提取5 min，取出冷卻后加入10 mL 乙酸乙酯-正己烷（2∶8，體積比）提取溶劑，振蕩提取2 min，10 000 r/min離心4 min。吸出上層有機(jī)相在50 ℃水浴內(nèi)氮?dú)獯抵粮桑尤? mL乙腈超聲溶解2 min，10 000 r/min離心2 min，取上層清液待測(cè)定。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：Agilent DB-5MS 石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣：高純氦氣，純度≥99.999%；分流模式：不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度：260 ℃，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：1.0 μL。程序升溫條件：起始溫度50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至250 ℃，再以50 ℃/min 升至300 ℃保持5 min，共20 min。溶劑延遲3.5 min。

縱觀莫言的“狂歡化”敘事可以發(fā)現(xiàn)，莫言取材于高密東北鄉(xiāng)的歷史與當(dāng)下的生活，在“高密東北鄉(xiāng)”的這個(gè)文學(xué)舞臺(tái)上不斷地書寫著過去先人的故事和當(dāng)下人民的生存狀態(tài)，以“狂歡”為聚焦點(diǎn)，表現(xiàn)出了對(duì)后代的無能與孱弱的批判，透過游戲戲謔的故事情節(jié)傳達(dá)出了深刻嚴(yán)肅的立意企圖。莫言作品中呈現(xiàn)出所謂的“狂歡化”現(xiàn)象正是狂歡化理論與文學(xué)脫節(jié)或者說是不同文化“雜交”的一種異態(tài)、異形產(chǎn)物，但是反思我們中國的文化背景以及新時(shí)期以來文學(xué)發(fā)展的特點(diǎn)，莫言式的“狂歡化敘事”算是一種較為成功的“雜交”產(chǎn)物，在精神、文化方面還是有較為深刻的內(nèi)涵，是值得肯定的。

質(zhì)譜條件：電離模式：電子轟擊離子化（EI），電離能量：70 eV，分析模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），CID氣：高純氬氣，離子源溫度：230 ℃，傳輸線溫度：280 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過質(zhì)譜全掃描模式，確定各化合物的特征碎片離子作為母離子，進(jìn)行子離子全掃描，選擇響應(yīng)強(qiáng)度較大的二級(jí)碎片離子作為子離子，確定定量和定性離子對(duì)，并優(yōu)化每個(gè)離子對(duì)的最優(yōu)碰撞能量，最終得到的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 19種待測(cè)物的保留時(shí)間和質(zhì)譜分析條件Table 1 Retention times and MS parameters for the analysis of 19 target compounds

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于各目標(biāo)物的極性不同，實(shí)驗(yàn)分別考察了DB-1701MS 和DB-5MS 色譜柱對(duì)19 種防腐劑的分離效果。結(jié)果顯示，當(dāng)采用DB-1701MS 色譜柱分析時(shí)，對(duì)羥基苯基酸酯類物質(zhì)的色譜峰拖尾嚴(yán)重；而采用DB-5MS 色譜柱分析時(shí)目標(biāo)峰的拖尾現(xiàn)象有所改善，且DB-5MS 色譜柱在質(zhì)譜分析時(shí)應(yīng)用較為普遍，也避免更換色譜柱時(shí)影響工作效率。因此，實(shí)驗(yàn)選擇DB-5MS 色譜柱進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)起始柱溫超過60 ℃時(shí)，富馬酸二甲酯的峰形拖尾嚴(yán)重，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［15］，所以本實(shí)驗(yàn)設(shè)置起始溫度為50 ℃，并將測(cè)定時(shí)間控制在16 min 內(nèi)，通過優(yōu)化色譜條件以降低色譜峰的拖尾程度。19 種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖如圖1 所示，各目標(biāo)物得到有效分離，可滿足測(cè)試要求。

圖1 19種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the mix standard solution of 19 compounds the peak numbers were the same as those in Table 1

2.3 樣品取樣方法的優(yōu)化

在竹木砧板樣品制備過程中，因?yàn)椴馁|(zhì)較硬不易將整塊砧板粉粹，大多采用正反梅花九點(diǎn)式布點(diǎn)法制備樣品。通常竹木砧板中五氯酚的檢出頻次及含量較高［16］，且五氯酚屬于人為添加物質(zhì)，存在分布不均勻問題，如果按照常規(guī)布點(diǎn)法制備樣品，取樣隨機(jī)性較大，只有砧板的雙面表層與食物相接觸，其中間部分未能接觸食品。實(shí)驗(yàn)比較了正反梅花九點(diǎn)式布點(diǎn)法和表層取樣法兩種制備方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響（見圖2）。選取16個(gè)五氯酚檢出含量較高的代表性樣本，對(duì)刨削及鉆孔下的樣品進(jìn)一步粉粹，按照優(yōu)化后的前處理方法操作后上機(jī)檢測(cè)，兩種制備方法下的五氯酚測(cè)定結(jié)果及比值關(guān)系如圖3所示。

圖2 長方形砧板九點(diǎn)式布點(diǎn)采樣法（A）及表層取樣法（B）示意圖Fig.2 Schematic diagram of nine-point sampling method（A）and surface sampling（B）for rectangular wooden chopping board

由圖3 可知，表層取樣法制備樣品的五氯酚檢出含量均高于九點(diǎn)式布點(diǎn)法，兩種制備方法的檢出含量比值在1.0～56.1 倍之間，推測(cè)五氯酚可能是以短暫浸泡的添加方式浸入竹木砧板內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)采用表層取樣法制備樣品。

圖3 兩種樣本制備方法下五氯酚的結(jié)果比較Fig.3 Comparison of pentachlorophenol results under two sample preparation methods

2.4 提取溶劑的優(yōu)化

通常竹木制品的化學(xué)防腐是將改性劑或防霉防腐等化學(xué)藥劑注入到竹木制品中，與竹材中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的活性基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)形成醚鍵、酯鍵或縮醛聯(lián)結(jié)，改變竹木制品的化學(xué)結(jié)構(gòu)［17］。目前提取不同種類防腐劑的溶劑主要有乙酸乙酯、正己烷等，本實(shí)驗(yàn)在空白竹木砧板基質(zhì)中添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察了分別以乙酸乙酯、乙酸乙酯-正己烷（8∶2）、乙酸乙酯-正己烷（6∶4）、乙酸乙酯-正己烷（4∶6）、乙酸乙酯-正己烷（2∶8）、正己烷為提取溶劑時(shí)19 種目標(biāo)物的平均提取效率，提取液體積均為10 mL。結(jié)果顯示：上述6 種提取溶劑的平均提取率分別為51.2%、65.6%、78.2%、81.2%、91.3%、92.5%，以正己烷作為提取溶劑時(shí)19 種目標(biāo)物的平均提取率最高，但鄰苯基苯酚的提取率只有54.6%，而乙酸乙酯-正己烷（2∶8）混合提取溶劑對(duì)19 種目標(biāo)物的提取率均高于65.0%，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以乙酸乙酯-正己烷（2∶8）作為提取溶劑。在其他操作相同條件下，分別考察了提取溶劑體積（5、10、15 mL）對(duì)提取效率的影響。結(jié)果顯示：當(dāng)提取溶劑體積為5 mL 時(shí)19 種目標(biāo)物的平均提取率為65.3%，以10 mL 提取時(shí)各組分的平均提取率為93.7%，而10 mL 及15 mL 時(shí)的提取率無較大差別。為節(jié)省溶劑，實(shí)驗(yàn)選擇以10 mL乙酸乙酯-正己烷（2∶8）為提取溶劑。

2.5 衍生化及凈化操作的討論

含氯酚是竹木制品中一類常用的防腐劑［18］，檢測(cè)時(shí)需在堿性環(huán)境中將乙酸酐五氯酚衍生成五氯苯乙酸酯，內(nèi)標(biāo)物2，4，6-三溴酚衍生成2，4，6-三溴苯乙酸酯，然后上機(jī)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)比較了含氯酚類物質(zhì)未衍生化及衍生化后的靈敏度差異。結(jié)果表明：在相同的儀器條件下，五氯酚衍生后的靈敏度約提高了10倍，內(nèi)標(biāo)物2，4，6-三溴酚約提高了40倍，2，4，6-三氯酚只提高了1.4倍。由于在木砧板中檢出五氯酚的濃度通常較高，所以本方法省略衍生化操作，利用GC-MS/MS 采用二級(jí)MS 離子定性，既可排除假陽性，又可提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性［19］，方法檢出限也滿足相關(guān)要求。

文獻(xiàn)報(bào)道中防腐劑的檢測(cè)采用SLC 固相萃取柱凈化法［20］。本實(shí)驗(yàn)在空白竹木砧板樣本中添加低濃度的19種防腐劑混標(biāo)，比較了樣本提取液經(jīng)SLC 固相萃取柱凈化前后的全掃描譜圖及平均回收率，分別在衍生化前、衍生化后進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，無論是在衍生化前還是衍生化后，過SLC 固相萃取柱的凈化效果一般，而且對(duì)測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性產(chǎn)生了影響，其次經(jīng)固相萃取法凈化后19種目標(biāo)物的平均回收率僅為76.2%，且聯(lián)苯等5種防腐劑的回收率低于60.0%。因此，本方法選擇不進(jìn)行凈化操作。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)考察了竹木制品中19 種防腐防霉劑檢測(cè)時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)（ME），通過不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在空白樣品基質(zhì)與純?nèi)軇┲行盘?hào)強(qiáng)度的比值百分比評(píng)價(jià)ME。比值百分比越接近100%，表明基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果影響越??；比值百分比大于100%，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；比值百分比小于100%，表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。結(jié)果顯示：五氯酚、2，4，6-三氯酚、苯噻氰、富馬酸二甲酯、苯甲醇、鄰苯基苯酚的比值百分比均大于130%，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、戊唑醇、抑霉唑、噻苯咪唑的比值百分比為110%～130%。為減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量的影響，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配工作曲線法進(jìn)行定量分析。

2.7 線性范圍、檢出限、定量下限及加標(biāo)回收率

取6 份木砧板空白樣品，按照本方法進(jìn)行樣品前處理至濃縮近干步驟，分別加入1 mL 6 個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。在最佳色譜條件下，利用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，以目標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL），繪制線性回歸方程。并采用空白樣品中添加目標(biāo)物的方法，以3 倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度確定檢出限（LOD），10 倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度確定定量下限（LOQ）。另取數(shù)份竹木砧板空白樣品，分別添加100、500 μL 不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，密閉常溫放置24 h 后按照本方法進(jìn)行樣品前處理，并上機(jī)分析，利用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定5次。結(jié)果如表2所示。

由表2可知，19種待測(cè)物在0.005～200.0 μg/mL范圍呈良好的線性關(guān)系（r2＞0.990），方法LOD 為0.001 ～0.17 mg/kg，LOQ為0.003 ～0.55 mg/kg；在低、高2個(gè)不同加標(biāo)水平下19種目標(biāo)物的回收率為65.8%～97.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為4.3%～13%。表明本方法具有較高的準(zhǔn)確度，能夠滿足檢測(cè)要求。

表2 19種待測(cè)物的線性關(guān)系、檢出限、定量下限及回收率Table 2 Linear relations，LODs，LOQs and recoveries of 19 target compounds

2.8 實(shí)際樣品分析

以2020 年貴州省食品安全風(fēng)險(xiǎn)專項(xiàng)監(jiān)測(cè)中對(duì)貴州省采集的80 批次市售竹木砧板及20 批次一次性筷子為實(shí)際樣品，采用本方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在65批次竹木砧板中檢出五氯酚，且非定型包裝竹木砧板中的檢出含量較高，2個(gè)批次一次性筷子中檢出對(duì)羥基苯基酸丙酯，含量為0.2 ～1.2 mg/kg，未發(fā)現(xiàn)其他防腐防霉劑超限量使用情況。

目前我國未對(duì)竹木砧板中五氯酚的殘留量做出限量要求。按照歐盟ResAP（2004）2決議中五氯酚的最大殘留量0.15 mg/kg 限量值［21］，本次監(jiān)測(cè)的竹木砧板中五氯酚的超標(biāo)率為72.5%。其中在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集的1 份非定型包裝竹木砧板中的殘留量最高為314.35 mg/kg，根據(jù)2018 年國家食品污染和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)［14］中五氯酚的檢測(cè)方法進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果為（312.23 ± 3.5）mg/kg，超出限量值2 000倍以上，與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符［22］。陽性樣品的檢測(cè)譜圖如圖4所示。

圖4 陽性樣品中五氯酚的MRM總離子流圖Fig.4 MRM total ion chromatograms of PCP in a positive sample

3 結(jié) 論

本研究建立了表層取樣結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定竹木砧板中19 種防腐防霉劑殘留的方法。該樣品制備方法可減少取樣隨機(jī)性，使樣品中目標(biāo)物更均勻，且前處理無需衍生化及凈化操作。方法簡便、高效，為竹木制品中防腐防霉劑的檢測(cè)提供了科學(xué)基礎(chǔ)。