魏 亮，張超楠，李科研，位婷婷，祁少可，王艷麗*，王 強，2，3*

（1.河南省生殖健康科學(xué)技術(shù)研究院 國家衛(wèi)健委出生缺陷預(yù)防重點實驗室，河南 鄭州 450002；2.河南省科學(xué)院高新技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002；3.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，河南 新鄭 450064；4.河南廣電計量檢測有限公司，河南 鄭州 450001）

山藥是薯蕷科植物的干燥根莖，屬多年生纏繞草本植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］，具有補脾養(yǎng)胃、生津益肺、補腎澀精等作用［2］。山藥大致可分食用、藥用兩類［3］，食用山藥稱薯，廣泛分布于非洲、亞洲、南美洲部分地區(qū)以及加勒比海和南太平洋的島嶼，是熱帶和亞熱帶地區(qū)人們的主食［4］。我國食用山藥主要分布在南方諸省，藥用山藥分布較北，主要以河南、山西、山東、河北為主［5］。此外，在朝鮮、日本等國也有分布［6］，并形成了地方品種。

道地藥材是指經(jīng)過中醫(yī)臨床長期應(yīng)用篩選出來的，產(chǎn)自特定地區(qū)，通過特定生產(chǎn)過程，較其他地區(qū)所產(chǎn)同種藥材質(zhì)優(yōu)效佳的藥材，它是優(yōu)質(zhì)中藥材的代名詞，其質(zhì)量優(yōu)劣與后續(xù)臨床用藥療效直接相關(guān)［7-8］。山藥自明代以后的道地產(chǎn)地逐漸集中到河南古懷慶府，即懷山藥?！侗静菝审堋吩疲骸澳媳笨ぞ惝a(chǎn)，惟懷慶者獨良”［9］。《本草原始》曰：“今人多用懷慶者，肉白指喜細(xì)，緊實者入藥”［10］。20 世紀(jì)30 年代《藥物出產(chǎn)辨》更是明確山藥“產(chǎn)河南懷慶府、沁陽、武陟、溫孟4 縣”［11］。懷山藥是地理標(biāo)志產(chǎn)品［12］。鐵棍山藥是懷山藥中的一種，被認(rèn)為是其中的極品［13］。

傳統(tǒng)上，道地藥材用眼觀、手摸、鼻聞、口嘗等主觀的性狀鑒別來判定，而現(xiàn)代多采用高效液相色譜、毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜等設(shè)備利用化學(xué)指紋圖譜對道地藥材進行鑒別［14］。本小組在前期研究中比較了溫縣鐵棍山藥與山東、山西種植鐵棍山藥以及山東、河北地方品種山藥中化學(xué)成分的差異以及鑒別方法［15］，本文則比較了沁陽、武陟、溫縣、孟州4地壚土地和沙土地產(chǎn)鐵棍山藥之間的化學(xué)成分差異。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

400 MR核磁共振波譜儀（美國安捷倫公司）；UltiMate3000高效液相色譜儀、超聲波振蕩器、HILIC氨 基 色 譜 柱（150 mm × 4.6 mm，2.6 μm）、Hypersil ODS C18色 譜 柱（60 mm × 4.6 mm，3 μm）（ThermoFisher 公司）；ME204E 型萬分之一天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；渦旋振蕩器、高速離心機（大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司）。

重水（D2O）和氘代甲醇（CD3OD）購自青島騰龍微波科技有限公司。乙腈（色譜純）購自默克公司。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

7種鐵棍山藥均采集自焦作地區(qū)，詳細(xì)信息見表1。原植物經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)謝小龍副教授鑒定為鐵棍山藥（Dioscorea polystachyaTruczaninow cv.Tiegun）。

表1 鐵棍山藥樣品信息Table 1 Sample information of Dioscorea polystachya Truczaninow cv.Tiegun

1.2 山藥處理方法

山藥采集后當(dāng)天去掉泥土，洗凈，去皮后切片烘干，粉碎得山藥粉，備用。

1.3 核磁共振分析

1.3.1 測試樣品制備稱取山藥粉（50 mg），加入0.4 mL 的磷酸緩沖液（0.05 mol/L Na2HPO4和NaH2PO4的重水溶液）以及0.4 mL 氘代甲醇，渦旋振蕩（3 min），離心（10 000 g，5 min），吸取上清液（550 μL）置于5 mm樣品管中。

1.3.2 測試條件核磁共振氫譜于室溫（298 K）測定，5 mm OneNMR 探頭，脈沖序列為PRESAT 以壓制樣品中的水峰，掃描次數(shù)64，譜寬4 800 Hz，采樣點數(shù)16 K，弛豫時間2 s，采集時間3.408 s。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析將采集得到的1H NMR 圖譜信號用MestreNova 軟件進行傅里葉變換，設(shè)置譜寬因子為0.3 Hz 的指數(shù)窗函數(shù)，手動進行相位校正，基線校準(zhǔn)，以3-（三甲基硅基）氘代丙酸鈉（TSP）為內(nèi)標(biāo)（δ0.0）校正位移。以δ0.02 為積分間隔對化學(xué)位移在δ0.5～9.5 之間的信號進行分段積分，其中去除δ3.28 ～3.34 和δ4.66～5.10 之間的信號，以避免CHD2OD 和HOD 殘留信號的干擾。將分段積分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.0 軟件中進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。200 次重復(fù)排列置換檢驗（Permutation test）評價OPLS-DA 模型的準(zhǔn)確性。使用OPLS-DA 模型的變量重要性投影（Variable important projection，VIP）對差異代謝物進行預(yù)選（VIP ＞1.0說明對分類有貢獻）。對核磁共振圖譜中未完全重疊的化合物信號通過積分（與TSP對比）進行單變量分析。

1.4 液相色譜分析

1.4.1 樣品前處理采用GB5009.8-2016［16］方法對山藥粉末進行提取以測定山藥中糖的含量，采用GB5009.157-2016［17］方法對山藥粉末進行提取以測定山藥中檸檬酸和蘋果酸的含量。

1.4.2 色譜測定條件糖含量測定：檢測器：示差折光檢測器；進樣量：20 μL；流動相：乙腈∶水=75∶25（體積比），等度洗脫；流速：1.0 mL/min。有機酸含量測定：檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：210 nm；進樣量：20 μL；流動相：0.1%磷酸溶液∶甲醇97.5∶2.5（體積比），等度洗脫；流速：0.8 mL/min。每個樣品測試不少于3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 代謝物的鑒定

鐵棍山藥的1H NMR譜圖如圖1所示，利用文獻數(shù)據(jù)［2，15，18-19］和對照品的1H NMR圖譜，共指認(rèn)30個化學(xué)成分，具體的特征化合物歸屬如表2 所示。對比前期研究中其他地區(qū)山藥的核磁共振圖譜，鐵棍懷山藥中少了葡萄糖和果糖信號的干擾，δ3.8 ～4.3 區(qū)間的絲氨酸、脯氨酸和蘇氨酸的信號更加清晰可辨。

表2 山藥主要代謝物的1H NMR圖譜歸屬Table 2 Assignments of1H NMR spectral peaks obtained from yams

圖1 山藥提取物的1H NMR圖譜Fig.1 1H NMR spectra of yam extracts 1-30 were the same as those shown in Table 2

2.2 差異代謝物的指認(rèn)

2.2.1 PCA 分析PCA 分析屬于無監(jiān)督的模式識別方法，能夠反映數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)，直觀地顯示不同樣品間的整體差異。7 種鐵棍山藥的PCA 圖（圖2）顯示第一主成分（PC1：56.0%，地域）和第二主成分（PC2：4.3%，土質(zhì)）可以解釋60.3%的原變量信息，不同產(chǎn)地的山藥樣本存在一定成分差異。溫縣、孟州、武陟的壚土和沙土山藥能夠通過PC2 分開，表明土質(zhì)差異對山藥的影響大于地域差異。7 種鐵棍山藥中，溫縣壚土和孟州壚土山藥成分更接近，而孟州沙土和武陟沙土山藥成分更接近。

圖2 7種山藥的PCA得分圖Fig.2 PCA score plot of 7 yams

（續(xù)表2）

2.2.2 OPLS-DA 分析PCA 分析為無監(jiān)督分析，可反映數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)，但不能消除組內(nèi)誤差和隨機誤差。而有監(jiān)督的OPLS-DA 能夠?qū)⑴cY矩陣相關(guān)的X 矩陣和與Y 矩陣無關(guān)的X 矩陣加以區(qū)分，消除組內(nèi)誤差及與研究目的無關(guān)的隨機誤差，體現(xiàn)數(shù)據(jù)的整體特征和變化規(guī)律，使兩組分類差別達到最大，從而確定兩組之間的化學(xué)成分差異，提高模型的有效性和解析能力。

溫縣壚土鐵棍山藥和孟州壚土鐵棍山藥OPLS-DA 模 型（圖3A）的R2X 為0.82，Q2為0.996，兩者均大于0.5且接近于1，表明模型高度可靠。在柱狀荷載圖中（圖3B），以VIP ＞1.0 作為標(biāo)準(zhǔn)，可知溫縣壚土山藥中精氨酸、檸檬酸和天冬氨酸含量較高；孟州壚土山藥中蘇氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蔗糖、蘋果酸、尿囊素含量較高。200 次重復(fù)排列置換檢驗的R2為0.373，Q2為-0.626（圖3C），表明模型不存在過度擬合。值得注意的是，載荷圖中顯示，溫縣壚土山藥的葡萄糖、果糖含量均低于其他幾種山藥，但是所有載荷圖中葡萄糖和果糖的VIP均小于1.0，并不是主要成分。

圖3 溫縣壚土鐵棍山藥和孟州壚土鐵棍山藥的OPLS-DA得分圖（A）、載荷圖（B）和模型驗證圖（C）Fig.3 OPLS-DA score plot（A），loading plot（B）and permutation test（C）of WL vs. ML

其他5種山藥與溫縣壚土山藥OPLS-DA 模型的R2X、Q2以及置換檢驗的R2、Q2值均表明這幾種山藥的模型高度可靠，不存在過度擬合，相關(guān)數(shù)據(jù)列于表3。

表3 OPLS-DA模型質(zhì)量的評價參數(shù)Table 3 Assessment parameters for the evaluation of OPLS-DA

2.2.3 代謝物相對含量比較以TSP為內(nèi)標(biāo)，對山藥中各化學(xué)組分定量積分，應(yīng)用Graph Prism 8.0對成分進行單變量分析。結(jié)果顯示，7種鐵棍山藥中，溫縣壚土山藥的精氨酸含量最高，孟州壚土山藥的蘇氨酸、谷氨酰胺含量最高，溫縣沙土山藥的丙氨酸和蘋果酸含量最高，武陟沙土山藥的尿囊素含量最高。此外，溫縣壚土和孟州壚土山藥還有最高含量的異亮氨酸、纈氨酸兩種必需氨基酸?？傮w來看，相較于外地種植鐵棍山藥和外地品種［15］，7種鐵棍山藥的化學(xué)成分差異不明顯，溫縣壚土山藥和孟州壚土山藥成分更為相似；3種沙土地的鐵棍山藥中2-羥基異丁酸的含量均高于壚土地山藥。

2.3 差異代謝物含量的測定

前期研究發(fā)現(xiàn)［15］，溫縣壚土鐵棍山藥的葡萄糖、果糖含量均低于外地種植的鐵棍山藥、地方品種山藥以及種植在溫縣地區(qū)的地方品種山藥，且可以利用溫縣壚土鐵棍山藥葡萄糖含量極低的特點用顯色劑進行鑒別。為了明確焦作各地區(qū)鐵棍山藥之間糖含量的差別，本文利用液相色譜測定了沁陽、武陟、溫縣、孟州4 地鐵棍山藥中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量，同時測定了檸檬酸和蘋果酸兩種有機酸的含量，結(jié)果見表4。

表4 液相色譜測得的鐵棍山藥中果糖、葡萄糖、蔗糖及檸檬酸、蘋果酸的含量Table 4 Contents of fructose，glucose，sucrose and citrate，malate in yams detected by HPLC （mean±SD，mg/g）

可以看出，焦作地區(qū)4 縣種植的7 種鐵棍山藥中均未檢出果糖和葡萄糖，蔗糖含量以溫縣壚土地鐵棍山藥最低，葡萄糖和果糖仍然可以作為鑒別道地鐵棍山藥的指標(biāo)。溫縣壚土地鐵棍山藥的檸檬酸含量最高，孟州壚土地鐵棍山藥的檸檬酸含量最低，溫縣沙土地鐵棍山藥的蘋果酸含量最高，與OPLS-DA 載荷圖結(jié)果一致，表明核磁共振氫譜中的積分面積能夠有效表達代謝物的含量趨勢。

3 結(jié) 論

山藥是常見的食藥兩用藥材，種植于焦作地區(qū)武陟、沁陽、溫縣、孟州4 地的鐵棍山藥均屬于道地藥材“懷山藥”。本文采用核磁共振結(jié)合多元統(tǒng)計分析對上述4 縣7 種鐵棍山藥中的化學(xué)成分差異進行了比較。通過核磁共振氫譜共鑒定化合物30種，多元統(tǒng)計結(jié)果顯示7種鐵棍山藥存在化學(xué)成分差異，但是明顯小于外地種植鐵棍山藥和外地品種山藥。7 種鐵棍山藥中，溫縣壚土鐵棍山藥和孟州壚土鐵棍山藥成分最為相似。此外，7 種鐵棍山藥中葡萄糖和果糖含量均小于2.0 mg/g，果糖和葡萄糖的含量、葡萄糖顯色試劑等仍適用于道地山藥的判別檢測［20-21］，也可利用電致化學(xué)發(fā)光酶生物傳感器檢測葡萄糖含量進行判別［22-23］。后續(xù)將結(jié)合動物實驗來驗證道地山藥和其他地區(qū)山藥之間的療效差異。