孫凌波，武文波，王清清，張?jiān)秸\(chéng)*，馬紅燕*

（1.延安大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000；2.延安大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，延安市分析技術(shù)與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000）

碳量子點(diǎn)（CQDs）具有光電性能優(yōu)異、生物相容性好、合成路線簡(jiǎn)單［1］等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境污染物控制［2］、腫瘤的納米治療［3］、膜改性技術(shù)［4］、生物樣品發(fā)光免疫檢測(cè)［5］等方面具有廣泛應(yīng)用。目前，利用CQDs的熒光分析大都基于單發(fā)射峰的熒光信號(hào)，易受激發(fā)光強(qiáng)度、探針濃度等因素的影響［6］，進(jìn)而影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。相比于單發(fā)射熒光探針，比率熒光探針具有內(nèi)校準(zhǔn)功能，可通過(guò)兩個(gè)熒光峰的比值消除或減少體系的干擾，使檢測(cè)的準(zhǔn)確性得到提高［7］。近年來(lái)，碳源材料的選擇、CQDs 制備方法［8］、信號(hào)響應(yīng)設(shè)計(jì)［9］以及比率型探針的構(gòu)建和應(yīng)用［10］成為新的研究熱點(diǎn)。

氯諾昔康（Lornoxicam，LNXC）為非甾體類藥［11］，用量不當(dāng)將導(dǎo)致腸胃出血、胃潰瘍和穿孔等不良癥狀。因此，尋找一種能準(zhǔn)確、靈敏、快速測(cè)定LNXC含量的方法非常重要。目前，測(cè)定LNXC的方法有基于銪（Ⅲ）熒光增敏的熒光分析法［12］、固相萃取-紫外可見(jiàn)分光光度法［13］、超聲輔助離子液體分散-液液微萃取光度法［14］、膠束協(xié)同作用下的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法［15］及HPLC 法［16］等。相較于其他方法，紫外可見(jiàn)分光光度法的靈敏度一般相對(duì)較低；化學(xué)發(fā)光分析法選擇性不夠好；HPLC 法通常需要復(fù)雜的儀器以及樣品預(yù)處理。熒光分析法憑借其簡(jiǎn)單、靈敏等優(yōu)勢(shì)受到了廣泛關(guān)注，尤其是基于CQDs的熒光分析法，近年來(lái)發(fā)展迅速。但目前為止，未見(jiàn)以CQDs 為參比信號(hào)構(gòu)建比率型熒光探針測(cè)定LNXC的研究報(bào)道。

本研究以天然生物質(zhì)扁豆為原料，通過(guò)一步水熱法合成了熒光性能優(yōu)良、水溶性好的扁豆CQDs（HB-CQDs），該量子點(diǎn)可通過(guò)靜電作用與異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）形成新型HB-CQDs/FITC 復(fù)合物探針。MnO-4可通過(guò)電子轉(zhuǎn)移和能量轉(zhuǎn)移猝滅HB-CQDs/FITC 于400 nm 和510 nm 兩峰處的雙發(fā)射熒光信號(hào)；加入LNXC 后，由于能量轉(zhuǎn)移過(guò)程受阻，復(fù)合物于510 nm 處的熒光信號(hào)恢復(fù)，而400 nm 處的熒光強(qiáng)度值基本不變。本文對(duì)上述體系的相互作用機(jī)理及熒光猝滅的類型進(jìn)行了探討，并提出了以HB-CQDs 為參比信號(hào)，F(xiàn)ITC 為響應(yīng)信號(hào)的雙發(fā)射比率型熒光探針HB-CQDs/FITC 測(cè)定LNXC 的新方法。相較于已有的LNXC 測(cè)定方法，該方法的碳源綠色環(huán)保，無(wú)任何其他試劑添加，一步水熱即可合成；同時(shí)比率型熒光探針的構(gòu)建減少了光源不穩(wěn)定等因素帶來(lái)的檢測(cè)誤差，顯著提高了分析方法的準(zhǔn)確度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4500 熒光光譜儀、HT7700 透射電鏡（日本日立）；XRD-7000 XRD 衍射儀、Prestige-21 型IR光譜儀（日本島津）；Agilent 8453UV-Vis光度計(jì)（美國(guó)安捷倫）；FLSP920瞬態(tài)熒光儀（英國(guó)愛(ài)丁堡）。

LNXC 標(biāo)準(zhǔn)品（上海甄準(zhǔn)生物科技公司，含量≥98.0%）；FITC（純度≥95%）購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，使用時(shí)配成5.0×10-5mol/L 的溶液；KMnO4（純度≥99.5%）購(gòu)于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，使用時(shí)配成5.0×10-6mol/L 的溶液；HAc-NaAc 緩沖溶液（pH 5.80，冰乙酸購(gòu)于天津耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司，純度≥99.5%；乙酸鈉購(gòu)于西安化學(xué)試劑廠，純度≥99.0%）；扁豆（市售）。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，試劑均為分析純級(jí)。

LNXC 標(biāo)準(zhǔn)液（1.0×10-3mol/L）：準(zhǔn)確稱取0.037 2 g LNXC 標(biāo)準(zhǔn)品，用5.00 mL NaOH（0.10 mol/L）溶解，攪拌、超聲后定容（100 mL），4 ℃冷藏，使用時(shí)稀釋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HB-CQDs 及HB-CQDs/FITC 復(fù)合物的合成HB-CQDs 的合成：將扁豆去皮、研碎成粉，稱取6.0 g，置于水熱釜中（50 mL），加20.0 mL 水，加熱20 h（180 ℃），冷至室溫，得到暗棕色HBCQDs 液，抽濾，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜處理后定容于100 mL，即得HB-CQDs 母液，冷藏（4 ℃）備用。稀釋200倍得到HB-CQDs工作液。

HB-CQDs/FITC 復(fù) 合 物 的 制 備：將5.00 mL 5.0×10-5mol/L 的FITC 溶 液 與HB-CQDs 工 作 液（17.0 mL）加入10.0 mL 的HAc-NaAc（pH 5.80）緩沖溶液中，室溫下超聲處理30 min 后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，即獲得HB-CQDs/FITC復(fù)合物。

1.2.2 HB-CQDs/FITC 比率型熒光探針的構(gòu)建將1.70 mL HB-CQDs/FITC、1.00 mL HAc-NaAc、0.80 mL 5.0×10-6mol/L KMnO4和一定量LNXC依次加入比色管（10 mL）中，定容，水?。?0 ℃）加熱20 min，流水冷至室溫后，測(cè)定其在單一激發(fā)波長(zhǎng)λex=326 nm 下，于λem為510 nm 和400 nm 兩處的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算其熒光強(qiáng)度比值I510nm/400nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 HB-CQDs的形貌表征

圖1A 為HB-CQDs的透射電鏡（TEM）圖，HB-CQDs的尺寸集中在5 nm 左右，無(wú)團(tuán)聚，呈規(guī)則的球形形態(tài)。圖1B為其X射線衍射（XRD）圖，2θ=28.96°處為無(wú)定形態(tài)碳的特征衍射峰，且在XRD圖中未發(fā)現(xiàn)明顯的晶格線，說(shuō)明制得的HB-CQDs 內(nèi)部碳源之間具有無(wú)序性［17］。因此，該HB-CQDs 的晶型為無(wú)定型碳。

圖1 HB-CQDs的TEM圖（A）和XRD譜（B）Fig.1 TEM image（A）and XRD pattern（B）of HB-CQDs insert：particle diameter distribution chart

2.2 HB-CQDs的光學(xué)性質(zhì)

掃描HB-CQDs 在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射圖，如圖2 所示。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)從306 nm 增加到346 nm 時(shí)，熒光發(fā)射峰從395 nm 紅移到414 nm，熒光強(qiáng)度先增大后減小，表明激發(fā)波長(zhǎng)影響HB-CQDs熒光強(qiáng)度的大小。這可能歸因于HB-CQDs的表面缺陷［18］和粒徑大?。?9］的不同。λex= 326 nm 時(shí)，熒光信號(hào)（IF）最大，此時(shí)，λem為400 nm。

圖2 不同激發(fā)波長(zhǎng)（λex）下HB-CQDs的熒光發(fā)射圖譜Fig.2 The fluorescence emission spectra of HB-CQDs under different excitation wavelengths

2.3 HB-CQDs/FITC復(fù)合物的光譜特性

對(duì)HB-CQDs、FITC 與HB-CQDs/FITC 復(fù)合物的熒光發(fā)射光譜進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3A 所示。由圖可以看出，在326 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下，HB-CQDs/FITC復(fù)合物分別于λem為510、400 nm 處有兩個(gè)明顯的發(fā)射峰，分別對(duì)應(yīng)于FITC與HB-CQDs的特征熒光峰。但HB-CQDs/FITC復(fù)合物的熒光強(qiáng)度較二者簡(jiǎn)單加和（HB-CQDs+FITC）強(qiáng)度有所降低，表明HB-CQDs與FITC之間有相互作用存在。

圖3B 為HB-CQDs、FITC 和HB-CQDs/FITC 復(fù)合物的UV-Vis 光譜。由圖可知，HB-CQDs 在271 nm 處有一強(qiáng)吸收峰，320 nm 處有一弱吸收峰，這兩個(gè)峰可能由共軛—C==C 的π-π*躍遷和—C==O 基團(tuán)的n-π*躍遷［20］形成，說(shuō)明HB-CQDs 溶液中有—COOH 等孤對(duì)電子官能團(tuán)存在；FITC 于495 nm 處有一強(qiáng)吸收峰；HB-CQDs/FITC 復(fù)合物于271、320、495 nm 處有3 個(gè)吸收峰，分別與HBCQDs和FITC 的特征吸收峰一致。但HB-CQDs/FITC 復(fù)合物的吸光度值較HB-CQDs與FITC 的吸光度的加和有所降低，該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明HB-CQDs和FITC之間相互作用的存在。

圖3C 是HB-CQDs、FITC 和HB-CQDs/FITC 的紅外光譜圖（IR），由圖可知：在HB-CQDs 中加入FITC后，HB-CQDs/FITC復(fù)合物中既有HB-CQDs 的特征基團(tuán)，又有FITC的特征基團(tuán)。HB-CQDs/FITC的紅外光譜圖中具有6個(gè)明顯的特征峰，其峰值為3 400、2 970、2 395、1 750、1 375、1 150 cm-1，分別對(duì)應(yīng)—OH、—CH2、—C≡C/—C≡N、—C==O、—C—O及—C—H的伸縮振動(dòng)。與HB-CQDs比較，F(xiàn)ITC偶聯(lián)在HB-CQDs表面后，—C==O的峰位置發(fā)生紅移，且峰強(qiáng)大大增加。綜上所述，表明已成功制備出HB-CQDs/FITC復(fù)合物，并有—COOH、—C==O、—OH等含氧的親水性基團(tuán)存在于HB-CQDs表面。

圖3 體系的熒光發(fā)射圖（A）、UV-Vis圖（B）和IR圖（C）Fig.3 The fluorescence spectra（A），UV-Vis absorption spectra（B）and infrared spectra（C）of the system

2.4 LNXC的測(cè)定原理

如圖4A中曲線4和5所示，在單一激發(fā)波長(zhǎng)λex=326 nm下，LNXC和MnO-4-LNXC均無(wú)明顯熒光。相同條件下，MnO-4的加入可使單一HB-CQDs 的熒光信號(hào)猝滅，再加入LNXC 則可使被猝滅的HBCQDs 的熒光得到一定程度的恢復(fù)（圖4B）。同時(shí)，測(cè)定了MnO-4和LNXC 分別對(duì)FITC 的響應(yīng)，從圖4C中可以看出，MnO-4的加入也使FITC 的熒光信號(hào)猝滅，但LNXC 對(duì)被猝滅的FITC 的熒光無(wú)恢復(fù)作用，反而與MnO-4有一定的協(xié)同猝滅作用。向HB-CQDs/FITC 復(fù)合物中加入MnO-4和LNXC時(shí)，MnO-4的加入使得HB-CQDs/FITC 復(fù)合物于510、400 nm 兩處的熒光強(qiáng)度均降低，發(fā)生雙猝滅；但向猝滅的體系中加入LNXC 后，F(xiàn)ITC 于510 nm 處的熒光信號(hào)重新“開(kāi)啟”，而被猝滅的HB-CQDs 在400 nm 處的熒光未恢復(fù)。HB-CQDs/FITC與MnO-4與LNXC的反應(yīng)也進(jìn)一步證明了HB-CQDs/FITC復(fù)合物的形成。

圖4 不同物質(zhì)結(jié)合的熒光發(fā)射譜圖Fig.4 The emission spectra of the combination of different components

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將不同濃度的LNXC加入到HB-CQDs/FITC-MnO-4體系后，λem=400 nm處的熒光強(qiáng)度基本不變，λem=510 nm 處的熒光強(qiáng)度則隨著LNXC 濃度的增加有規(guī)律的增強(qiáng)。據(jù)此，可基于I510nm/400nm與LNXC濃度之間的線性關(guān)系構(gòu)建內(nèi)標(biāo)型比率熒光探針，實(shí)現(xiàn)LNXC的高靈敏度、高選擇性檢測(cè)。

2.5 LNXC測(cè)定條件的優(yōu)化

2.5.1 pH 值及緩沖溶液FITC 在不同酸度下主要存在4 種型體，酸性或弱酸性條件下主要以FH3+或FH2的形式存在，而堿性或弱堿性條件下主要以FH-和F2-的形式存在［21］。因此，對(duì)測(cè)定體系pH值、緩沖液種類（Na2HPO4-檸檬酸、HAc-NaAc、K2HPO4-NaOH和BR）及用量進(jìn)行了優(yōu)化。如圖5所示，選擇加入pH 5.80的HAc-NaAc緩沖溶液1.0 mL。

圖5 pH值（A）、緩沖液種類（B）和緩沖液用量（C）對(duì)HB-CQDs/FITC-MnO-4 和HB-CQDs/FITC-MnO-4-LNXC體系的影響Fig.5 The effect of pH value（A），buffer（B）and buffer dosage（C）on HB-CQDs/FITC-MnO-4 and HB-CQDs/FITC-MnO-4-LNXC systems

2.5.2 MnO-4 用量的選擇MnO-4的用量影響LNXC 檢測(cè)的靈敏度及線性范圍。對(duì)MnO-4的用量進(jìn)行了優(yōu)化，如圖6所示。實(shí)驗(yàn)選擇加入0.80 mL 5.0×10-6mol/L的MnO-4。

圖6 MnO-4的用量對(duì)HB-CQDs/FITC-MnO4-和HB-CQDs/FITC-MnO-4-LNXC體系的影響Fig.6 The effects of MnO-4 dosage on HB-CQDs/FITC-MnO-4 and HB-CQDs/FITCMnO-4-LNXC systems

2.5.3 體系的反應(yīng)時(shí)間與溫度向被MnO-4猝滅的體系中加入一定量的LNXC 后，體系熒光信號(hào)比值I510nm/400nm在常溫下恢復(fù)較緩慢。因此，考察了不同水浴溫度（室溫、水浴40 ℃、60 ℃和80 ℃）和時(shí)間對(duì)I510nm/400nm的影響。結(jié)果表明：在60 ℃水浴鍋中加熱20 min，熒光恢復(fù)比達(dá)最大，且在7.5 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.5.4 特異性取cLNXC=5.0×10-6mol/L，在相對(duì)誤差±5%范圍內(nèi)，以下可能存在的離子及藥物輔料均不影響LNXC的測(cè)定：葡萄糖、羧甲基淀粉鈉、纖維素、十二烷基硫酸鈉、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO24-、NO（-31 000倍）；Ni2+、Ag+、Co2+、Cu2+、D-果糖、Zn2+（500倍）；Mn2+、Al3+、F-、CN-、SO2-3（200 倍）；Fe3+（50 倍）；Hg2+（20 倍）；Cr（Ⅵ）（5倍）。

2.5.5 線性范圍與檢出限在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，LNXC在1.0×10-7～1.0×10-5mol/L 濃度范圍內(nèi)與HB-CQDs/FITC體系位于兩發(fā)射波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度的比值（I510nm/400nm）呈良好線性關(guān)系，線性方程為I510nm/400nm= 2.2 × 105c+ 1.3（r= 0.998 0）。方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%（n=11，c=5.0×10-6mol/L）。根據(jù)IUPAC 的規(guī)定，以3σ/k計(jì)算得到檢出限（DL）為9.0×10-8mol/L。

2.6 樣品分析及加標(biāo)回收

隨機(jī)取同一批LNXC 10片（標(biāo)示量：0.008 g），研成粉末，稱取0.701 7 g（相當(dāng)于0.037 2 g LNXC），用NaOH（0.10 mol/L）溶解，以水定容至100 mL。過(guò)濾，移取適量濾液測(cè)定LNXC 含量，結(jié)果見(jiàn)表1。為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。于樣品溶液中加入3.00 mL 1.0 × 10-5mol/L 的LNXC標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測(cè)定，該方法的回收率為99.8%～105%，RSD不大于2.0%。

表1 LNXC樣品的測(cè)定及加標(biāo)回收率（n=5）Table1 Determination of LNXC in tablets and spiked recovery（n=5）

2.7 機(jī)理初探

對(duì)反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了初步探討。首先，于λem= 510 nm 處測(cè)定了HB-CQDs/FITC 及HB-CQDs/FITC-MnO-4體系的熒光壽命（τ），結(jié)果見(jiàn)表2。其中，HB-CQDs/FITC 的加權(quán)平均熒光壽命（τ）［22］為4.05 ns，HB-CQDs/FITC-MnO-4為3.90 ns，τ1/τ0≈1。表明MnO-4與HB-CQDs/FITC 探針的相互作用方式為靜態(tài)猝滅。

表2 熒光壽命對(duì)比Table 2 The comparation of fluorescence lifetime

其次，對(duì)體系的UV-Vis 吸收光譜進(jìn)行研究。如圖7A 所示，HB-CQDs/FITC 復(fù)合物有3 個(gè)吸收峰，分別位于271、320、495 nm 處，MnO-4在505、525、545 nm 處有吸收峰。加入MnO-4后，HBCQDs/FITC位于271 nm和495 nm處的吸收峰消失，于350 nm處出現(xiàn)了新的吸收峰，其吸收光譜發(fā)生明顯變化。由于靜態(tài)猝滅會(huì)改變物質(zhì)的UV-Vis 譜圖［23］，因此說(shuō)明MnO-4與HB-CQDs/FITC 之間以靜態(tài)猝滅的方式相互作用，這與熒光壽命的推論一致。

圖7B 為MnO-4、LNXC 及MnO-4-LNXC 體系的UV-Vis 吸收光譜圖，在MnO-4溶液中加入LNXC 后，MnO-4的吸收峰消失，LNXC位于380 nm的峰也不復(fù)存在，表明LNXC與MnO-4之間發(fā)生了相互作用，有新物質(zhì)生成。

圖7 HB-CQDs/FITC-MnO-4（A）和MnO-4-LNXC（B）體系的UV-Vis光譜Fig.7 The UV-Vis absorption spectra of HB-CQDs/FITC-MnO（-4A）and MnO-4-LNXC（B）systems

綜上，體系可能的機(jī)理如下：pH 5.80 時(shí)，F(xiàn)ITC 的水溶液呈正電性［21］，可與表面存在大量—C—OR、—COOH 等吸電子基團(tuán)且?guī)ж?fù)電荷的HB-CQDs 通過(guò)靜電相互作用［24］自組裝形成HB-CQDs/FITC復(fù)合物。加入MnO-4后，因MnO-4易得電子，可與HB-CQDs/FITC 發(fā)生電子轉(zhuǎn)移［25］，使HB-CQDs/FITC的熒光信號(hào)猝滅；同時(shí)，HB-CQDs/FITC 發(fā)射光譜中510 nm 處FITC 的峰與MnO-4的吸收光譜部分重疊，當(dāng)MnO-4加入到HB-CQDs/FITC 復(fù)合物溶液中時(shí)，也可通過(guò)內(nèi)濾效應(yīng)（IFE）［26］的方式使其熒光猝滅；圖7B顯示LNXC可與MnO4-結(jié)合形成新物質(zhì)，而LNXC的加入使MnO-4與FITC之間的能量轉(zhuǎn)移過(guò)程受阻，F(xiàn)ITC 被釋放，使HB-CQDs/FITC 于510 nm 處的熒光信號(hào)重新開(kāi)啟，但MnO-4與HB-CQDs 之間的相互作用仍然存在，因此400 nm處的熒光信號(hào)基本保持不變。體系可能的機(jī)理如圖8所示。

圖8 HB-CQDs比率型探針作用機(jī)理圖Fig.8 Mechanism diagram based on HB-CQDs ratiometric fluorescent probe

3 結(jié) 論

本文以綠色天然生物質(zhì)扁豆為前驅(qū)體一步制備了綠色熒光HB-CQDs，其可與FITC 復(fù)合形成具有雙發(fā)射熒光信號(hào)的新型HB-CQDs/FITC 探針?；贛nO-4的加入可使探針510 nm/400 nm 兩處的熒光信號(hào)發(fā)生猝滅，而LNXC 的加入可使510 nm 處的熒光恢復(fù)，構(gòu)建了“關(guān)-開(kāi)”型HB-CQDs/FITC 比率熒光探針對(duì)LNXC進(jìn)行高靈敏檢測(cè)。方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，為L(zhǎng)NXC的熒光測(cè)定提供了新思路。