張黎軍 趙盼盼 徐志秀 王凡 王朔 任靜 袁彬 吉四輩

星形膠質(zhì)細胞是膠質(zhì)細胞中體積最大的一種，在哺乳動物腦內(nèi)分布最為廣泛，在血腦屏障形成、神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)中起到重要作用[1]。有研究顯示，星形膠質(zhì)細胞在細胞遷移中參與了神經(jīng)退行過程[2]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮了傳遞神經(jīng)遞質(zhì)等多種生物學作用。星形膠質(zhì)細胞可以在帕金森病患者及帕金森病動物模型中呈現(xiàn)出活化狀態(tài)，在病理狀態(tài)下其線粒體功能受損[3]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達上調(diào)是活化狀態(tài)的主要表現(xiàn)，若抑制GFAP的表達，神經(jīng)損傷后軸突再生功能會大幅度降低。李燕華等[4]研究結(jié)果表明，慢病毒轉(zhuǎn)染基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9會下調(diào)水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）的表達，這可為利用星形膠質(zhì)細胞進行缺血性腦水腫實驗提供參考。MMP-2、MMP-9均屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族[5]，兩者在細胞中發(fā)揮著重要作用[6]。蛋白質(zhì)磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是一種異源三聚體蛋白，能夠參與多種生物學功能的調(diào)節(jié)。有研究表明，PP2A升高對轉(zhuǎn)基因損傷小鼠神經(jīng)功能有一定的改善作用[7]，p38是絲裂原活化蛋白激酶中重要成員，參與細胞信號轉(zhuǎn)導過程[8-9]。本研究探討PP2A激活劑對星形膠質(zhì)細胞遷移能力的影響及相關(guān)作用機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實驗動物：選取出生48 h內(nèi)健康、清潔級SD雄性大鼠，均由華北理工大學科學院提供[許可證號：SYXK（冀）2020-007]。飼養(yǎng)溫度 20～25 ℃，濕度為50%，人工飼養(yǎng)3 d。（2）主要試劑：大鼠抗小鼠磷酸化 p38（phosphorylation of p38，p-p38）抗體由武漢益普生物科技有限公司提供，PP2A活性試劑盒由上海瓦蘭生物科技有限公司提供；人抗大鼠MMP-2抗體、MMP-9抗體由上海恒斐生物科技有限公司提供。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批準文號：21000092017072）。

1.2 方法

1.2.1 星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng) 參照張黎軍等[10]星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)方法：采用75%乙醇對大鼠消毒，以斷頸法處死，快速將大鼠大腦組織取出并放置在平皿中，連續(xù)洗滌3次，提取大鼠大腦皮層組織，剝除血管膜并剪碎，加入0.125%胰蛋白酶2 ml消化15 min，每3 min進行1次搖晃，待其完全消化后，將其置于含有10%FBS的杜爾貝科伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）中，加入適量細胞培養(yǎng)液使細胞懸浮，隨后在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為5%CO2、37℃。每3 d更換1次培養(yǎng)液，9 d后密封培養(yǎng)瓶，置于37℃搖床中，待細胞分離后檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GEAP）表達，若檢測陽性，即提示星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)完成。更換培養(yǎng)液，重復以上步驟，選取第2代星形膠質(zhì)細胞備用。

1.2.2 細胞分組 將培養(yǎng)后的第2代星形膠質(zhì)細胞分為抑制組、激活組、對照組3組。抑制組加入15 nmol/L PP2A抑制劑岡田酸；激活組加入15 nmol/L PP2A激活劑鞘胺醇（d-erythro-sphingosine，DES）；對照組加入等體積二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），每組細胞在用乙二胺四乙酸胰酶消化后，以5×104/ml的密度接種在鋪有蓋玻片（預先采用多聚賴氨酸包被）的6孔板內(nèi)，在5%CO2、37℃下恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，備用。

1.2.3 PP2A活性檢測 采用放射免疫沉淀法，3組細胞均加入細胞裂解液，在冰上裂解20 min后轉(zhuǎn)移至微型離心管（micro centrifuge tube，EP）中，在 4 ℃下離心處理10 min，分離蛋白上清液后在EP內(nèi)保存，采用二喹啉甲酸蛋白試劑盒檢測蛋白濃度，滴加50 μg蛋白樣品后，采用PP2A活性檢測試劑盒完成PP2A活性檢測。

1.2.4 星形膠質(zhì)細胞遷移率的觀測 采用細胞染色觀察法。采用胰蛋白酶將3組細胞完全消化，分別滴加含有1%FBS培養(yǎng)懸液細胞，細胞濃度為1×105個/ml，在 Transwell小室上室中加入 500 μl細胞懸液，在Transwell小室下室中加700 μl 10%的FBS細胞液，將Transwell小室放置在12孔板上，培養(yǎng)8 h后，使用棉簽將上層多余細胞擦掉，固定5 min。采用日本奧林巴斯BX43光學顯微鏡觀察細胞遷移數(shù)目，在25℃下使用Giemsa染料染色15 min后統(tǒng)計遷移總細胞數(shù)目，并計算細胞遷移率，細胞遷移率=遷移總細胞數(shù)目/膜下層細胞×100%，重復上述步驟3次，取平均值。

1.2.5 p-p38、MMP-2、MMP-9的檢測 采用電泳洗滌法。提取3組細胞中總蛋白，加入5×十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate crystals，SDS）上樣緩沖液，每孔劑量20 μg。于120 V電壓下，電泳1.5 h至形成聚偏二氟乙烯膜后，采用5%脫脂奶粉封閉，加入一抗Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBS with tween-20，TBST），p-p38、MMP-2、MMP-9按照1:2 000稀釋或在溫室下孵育12 h后在4℃條件下進行震蕩過夜，再次洗滌，加入二抗溶液 TBST，p-p38、MMP-2、MMP-9 按照 1∶5 000 稀釋，震蕩120 min后，洗滌，顯色成像，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組細胞PP2A活性比較 3組細胞PP2A活性比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。抑制組PP2A活性51.22±8.98，低于激活組的135.89±11.25及對照組的102.15±10.15，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；激活組PP2A活性高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 3組細胞遷移率的比較 3組細胞遷移率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。抑制組細胞遷移率0.15±0.02，低于激活組的0.42±0.03及對照組的 0.23±0.01，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；激活組細胞遷移率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。光學顯微鏡下3組細胞遷移情況見圖1。

圖1 光鏡下3組細胞遷移情況（×100）

抑制組細胞外基質(zhì)內(nèi)的細胞遷移數(shù)目低于激活組、對照組；激活組細胞外基質(zhì)內(nèi)的細胞遷移數(shù)目高于對照組。

2.3 3組細胞中 p-p38、MMP-2、MMP-9 表達水平比較 3組細胞中p-p38、MMP-2、MMP-9表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。抑制組pp38表達水平高于對照組、激活組，激活組p-p38表達水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。抑制組MMP-2、MMP-9表達水平均低于對照組、激活組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=22.360、12.280、17.000、12.330，均 P＜0.05）；激活組 MMP-2、MMP-9 表達水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=7.000、3.796，均P＜0.05），見表 1。3 組 p-p38、MMP-2、MMP-9 表達水平比較見圖2、圖3。

表1 3組細胞中p-p38、MMP-2、MMP-9表達水平比較

圖2 3組p-p38蛋白表達的電泳圖

圖3 3組MMP-2、MMP-9表達的電泳圖

3 討論

星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系密切，對神經(jīng)細胞的生長具有一定的營養(yǎng)作用，在神經(jīng)系統(tǒng)中具有廣泛的生物學功能[11]。李昕華等[12]研究結(jié)果表明，處理后的星形膠質(zhì)細胞分泌膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子能起到抑制p38MAPK信號通路的作用，并且抑制神經(jīng)元細胞的減少，發(fā)揮保護腦神經(jīng)的作用。

PP2A含有較大數(shù)量的三聚體，對細胞中多種蛋白能起到直接作用，在多種生物學功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。有研究表明，其活性的降低能夠破壞神經(jīng)元軸突功能的發(fā)揮[14]。本研究結(jié)果顯示，激活組PP2A活性明顯高于抑制組、對照組，此結(jié)果說明，PP2A激活劑能提高機體中PP2A活性。細胞遷移屬于一種細胞運動，在多種過程中均發(fā)揮著重要作用，如傷口愈合、癌癥進展、免疫反應(yīng)等[15]。本研究結(jié)果顯示，激活組細胞遷移率明顯高于抑制組、對照組，此結(jié)果說明，PP2A激活劑能夠顯著促進星形膠質(zhì)細胞遷移，從而提高星形膠質(zhì)細胞遷移的能力。李夏春等[16]研究結(jié)果表明，上調(diào)PP2A能夠改善淀粉樣前體蛋白/早老蛋白-1雙轉(zhuǎn)基因小鼠病理改變，具有改善學習記憶能力的作用，與本文研究結(jié)果一致。趙鑫等[17]研究中，采用Transwell小室細胞遷移實驗和細胞劃痕實驗檢測小干擾RNA調(diào)節(jié)ski基因（ski gene-small interfering RNA，ski-siRNA）轉(zhuǎn)染后星形膠質(zhì)細胞遷移能力的變化發(fā)現(xiàn)，ski-siRNA轉(zhuǎn)染組每孔遷移細胞數(shù)少于空白對照組和陰性對照組。細胞劃痕實驗顯示,轉(zhuǎn)染組細胞1～5 d的劃痕愈合率均明顯低于對照組，證實沉默ski基因能顯著抑制星形膠質(zhì)細胞的遷移能力。

MMP-2、MMP-9兩者在細胞中發(fā)揮著重要作用。盧文玉等[18]研究結(jié)果表明，ApoE能夠調(diào)節(jié)膠質(zhì)細胞分泌的MMP-9表達，影響血腦屏障完整性。本研究結(jié)果顯示，激活組中MMP-2、MMP-9表達水平明顯高于抑制組、對照組，說明PP2A激活劑通過上調(diào)MMP-2、MMP-9表達，可促進星形膠質(zhì)細胞的遷移。

p38參與細胞信號轉(zhuǎn)導過程。本研究中，激活組p-p38表達量較抑制組、對照組較低，說明PP2A激活劑通過降低p-p38磷酸化水平，從而降低了p38水平。雷雨廣等[19]研究結(jié)果表明，PDIA3過表達能夠改善H2O2誘導的星形膠質(zhì)細胞氧化應(yīng)激損傷及炎性反應(yīng)，其能夠通過抑制p38MAPK通路的激活發(fā)揮其作用。邵廣田等[20]研究結(jié)果顯示，缺氧組p-p38表達顯著高于正常組,而缺氧+SB203580組p-p38表達顯著低于缺氧組，說明p38信號通路的激活降低了缺氧下星形膠質(zhì)細胞增殖并促進細胞的凋亡，而抑制p38信號通路可提高細胞的增殖及抑制細胞的凋亡。本文研究尚未證實這一觀點，因此仍需要做后續(xù)實驗加以證實。

綜上所述，PP2A激活劑通過調(diào)控p38MAPK信號通路，能提高星形膠質(zhì)細胞中PP2A活性及星形膠質(zhì)細胞遷移能力，為臨床研究神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供理論依據(jù)。