周金梅，熊柳冰，黃 浩

（惠東縣人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東 惠東 516300）

從癌細(xì)胞中提取DNA 是檢測表皮生長因子受體（EGFR）突變的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但手術(shù)前患者組織樣本的獲取十分困難，對(duì)臨床治療的指導(dǎo)具有滯后性[1]。許多研究者逐漸采用胸腔積液等易獲取的樣本替代組織樣本進(jìn)行DNA 分析，但存在較高的誤診率。由于EGFR 突變分析通常是在細(xì)胞學(xué)診斷中的免疫染色之后進(jìn)行，而惡性胸腔積液一般屬于滲出液，因此可用于EGFR 突變分析的沉淀物較為有限[2]。同時(shí)，當(dāng)沉淀物中癌細(xì)胞很少時(shí)，EGFR 突變分析會(huì)產(chǎn)生假陰性的結(jié)果[3]。此外，采用胸腔積液標(biāo)本檢測EGFR 突變狀態(tài)與細(xì)胞學(xué)診斷之間的關(guān)系尚不清楚。因此，我們猜測聯(lián)合檢測胸腔積液中細(xì)胞沉淀物DNA 和無細(xì)胞上清液基因組DNA（cell-free DNA，ccfDNA）可能比單獨(dú)使用細(xì)胞沉淀物DNA 或上清液ccfDNA檢測更能有效診斷EGFR 突變狀態(tài)?；诖耍狙芯刻接懖捎枚鷾y序技術(shù)檢測胸腔積液中細(xì)胞沉淀物DNA 及上清液ccfDNA 的臨床價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 基線資料

選取2016 年1 月至2020 年10 月我院收治的156 例肺腺癌患者作為研究對(duì)象。其納入標(biāo)準(zhǔn)是：經(jīng)病理學(xué)檢查或細(xì)胞學(xué)檢查明確診斷患有肺腺癌，且癌細(xì)胞存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；出現(xiàn)胸腔積液；知曉本研究內(nèi)容，并簽署了知情同意書。其排除標(biāo)準(zhǔn)是：存在其他類型的惡性腫瘤；合并有免疫系統(tǒng)疾病、炎性疾病等可能產(chǎn)生胸腔積液的疾病；基因檢測前已接受放化療等抗腫瘤治療；病歷資料缺失。在156 例肺腺癌患者中，有45 例（28.8%）患者檢測出EGFR 突變（EGFR 突變采用TaqMan 突變檢測法進(jìn)行檢測）。將45 例EGFR 突變型肺腺癌患者作為EGFR 突變組，另選同期我院收治的29例野生型EGFR 且上清液樣本充足的肺腺癌患者作為EGFR 野生組。兩組患者的基線資料見表1。

表1 兩組患者基線資料的比較

1.2 方法

1.2.1 組織標(biāo)本、胸腔積液標(biāo)本的收集 收集患者的胸腔積液細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，在800 g 條件下離心10 min，收集上清液后立即保存在-80℃的冰箱中，直到提取DNA。取標(biāo)本中的細(xì)胞沉淀物，將細(xì)胞沉淀物浸泡在固定液中至少30 min。每個(gè)液基細(xì)胞學(xué)（liquid based cytology，LBC）涂片都采用SurePathTM 系統(tǒng)進(jìn)行處理，然后將LBC 玻片用Papanicolaou 法染色以進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷。液基胸腔積液細(xì)胞學(xué)檢查中肺腺癌的典型細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)見圖1。同時(shí)，在胸腔鏡下夾取適量組織標(biāo)本，并通過細(xì)胞抽吸或在術(shù)后病理組織中獲取轉(zhuǎn)移的腫瘤標(biāo)本。

圖1 液基胸腔積液細(xì)胞學(xué)檢查中肺腺癌的典型細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)

1.2.2 高通量二代測序分析 采用TaqMan 突變檢測法或F-PHFA 法檢測EGFR 基因第19 號(hào)外顯子（DelE746A750）和第21 號(hào)外顯子（L858R）突變的情況。提取胸腔積液中LBC 涂片的細(xì)胞沉淀物和上清液基因組DNA（cell-free DNA，ccfDNA），DNA 含量用生物光度計(jì)進(jìn)行檢測。從惡性細(xì)胞涂片中提取DNA，利用NextSeq 500 高通量測序平臺(tái)，采用二代測序技術(shù)檢測組織、細(xì)胞等樣本中基因變異序列的數(shù)目及EGFR 基因變異的情況。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察采用胸腔積液中細(xì)胞沉淀物DNA、上清液ccfDNA 單獨(dú)檢測及聯(lián)合檢測評(píng)估EGFR 突變的結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 20.0 軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用±s表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用% 表示，用χ2 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胸腔積液中細(xì)胞沉淀物DNA、上清液ccfDNA單獨(dú)檢測評(píng)估兩組患者EGFR 突變的情況

EGFR 野生組患者胸腔積液中所有細(xì)胞沉淀物DNA、上清液ccfDNA 單獨(dú)檢測的結(jié)果均顯示EGFR 突變呈陰性，EGFR 突變組患者胸腔積液中細(xì)胞沉淀物DNA、上清液ccfDNA 單獨(dú)檢測的結(jié)果均顯示原發(fā)灶和相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶EGFR 基因第19 號(hào)、21 號(hào)外顯子的突變情況無差異。

2.2 胸腔積液中細(xì)胞沉淀物DNA、上清液ccfDNA聯(lián)合檢測評(píng)估兩組患者EGFR 突變的情況

在EGFR 突變組患者中，細(xì)胞沉淀物DNA 中EGFR 突變與上清液ccfDNA 中EGFR 突變的符合率為35.6%（16/45），表明這兩種標(biāo)本在EGFR突變檢測中經(jīng)常表現(xiàn)出不一致。對(duì)這兩種標(biāo)本進(jìn)行聯(lián)合檢測后發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測可將EGFR 突變檢測的敏感度提高至60.0%。詳見表2。

表2 胸腔積液中細(xì)胞沉淀物、上清液ccfDNA 聯(lián)合檢測評(píng)估兩組患者EGFR 突變的情況[ 例（%）]

3 討論

胸腔積液或血漿中的游離DNA 可用來檢測EGFR 突變，這不僅有助于肺癌治療方案的制定，還有利于動(dòng)態(tài)監(jiān)測患者的治療效果。研究證實(shí)，胸腔積液標(biāo)本中的EGFR 突變篩查對(duì)于預(yù)測肺癌患者的預(yù)后十分有效[4]。Karlovich 等[5]通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)，從液體標(biāo)本上清液中提取的ccfDNA 中可檢測到激活的EGFR 突變，這可能是一種通過形態(tài)學(xué)和DNA 分析實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌快速診斷的敏感方法。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)胸腔積液中細(xì)胞沉淀物DNA 和上清液ccfDNA 聯(lián)合檢測，共在27 個(gè)樣本中發(fā)現(xiàn)EGFR 突變，檢測的敏感性為60.0%。提示采用二代測序技術(shù)同時(shí)對(duì)胸腔積液中細(xì)胞沉淀物DNA 和上清液ccfDNA 進(jìn)行基因分析對(duì)于準(zhǔn)確檢測EGFR 突變具有重要的意義。近年來，已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌EGFR 突變與相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶的EGFR 突變不一致。Zhao 等[6]報(bào)道，原發(fā)性肺癌EGFR 的狀態(tài)不能完全正確地預(yù)測相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶中EGFR 的狀態(tài)。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，雖然腫瘤組織樣本中EGFR 的突變率略高于胸腔積液樣本中EGFR 的突變率，但二者相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究中，細(xì)胞沉淀物和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中EGFR 突變型的檢出率并不完全一致。從樣本中提取的DNA 質(zhì)量不佳或腫瘤細(xì)胞存在異質(zhì)性可能是導(dǎo)致兩個(gè)樣本中EGFR 突變型檢出率不一致的原因。而聯(lián)合檢測細(xì)胞沉淀物DNA 和上清液ccfDNA，可提高原發(fā)腫瘤與相應(yīng)轉(zhuǎn)移瘤中EGFR 突變的符合率。在臨床上，術(shù)前獲取患者的腫瘤組織樣本比較困難，這促使研究者開始使用血漿或胸腔積液等體液樣本進(jìn)行DNA 分析，而這些樣本中通常含有循環(huán)中的無細(xì)胞DNA。在以往的無細(xì)胞DNA 研究中，研究人員研發(fā)了多種肺癌患者血漿/ 血清樣本中EGFR 突變的檢測技術(shù)，如擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)、高效液相色譜等，報(bào)告的檢測靈敏度在43.1%～91.7%之間。在本研究中，我們主要采用二代測序法來檢測胸腔積液中細(xì)胞沉淀物DNA 和上清液ccfDNA 中的EGFR 突變，因此報(bào)告的陽性率比以往的研究更高。在非惡性細(xì)胞標(biāo)本的上清液ccfDNA 中無法檢測到EGFR突變，因此我們認(rèn)為腫瘤細(xì)胞未侵犯支氣管的肺癌患者上清液中的無細(xì)胞DNA 不在支氣管內(nèi)循環(huán)。相比之下，晚期肺癌患者通常會(huì)出現(xiàn)胸腔積液，這些患者的無細(xì)胞DNA 可能在全身循環(huán)，而不僅僅是在支氣管內(nèi)循環(huán)[7]。盡管導(dǎo)致EGFR 突變陽性標(biāo)本出現(xiàn)假陰性的原因尚不清楚，但在細(xì)胞學(xué)上，這些非小細(xì)胞肺癌病例的癌細(xì)胞可能較小，且有更多的單細(xì)胞核或未成熟的未分化細(xì)胞，這些細(xì)胞在大小、染色程度或形態(tài)上可能與典型非小細(xì)胞肺癌患者的癌細(xì)胞不同。

綜上所述，采用二代測序技術(shù)對(duì)胸腔積液中細(xì)胞沉淀物DNA 和上清液ccfDNA 進(jìn)行聯(lián)合檢測可有效提高原發(fā)腫瘤和相應(yīng)轉(zhuǎn)移瘤之間EGFR 突變的符合率。