陳懇，馮海娟，王海云，許偉

結(jié)直腸癌是我國(guó)乃至全世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位列所有腫瘤的第四位，而死亡率卻高居所有惡性腫瘤的第二位，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命健康［1-3］。手術(shù)切除是目前結(jié)直腸癌的主要治療方式，然而術(shù)后高復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移使結(jié)直腸癌患者的總體預(yù)后仍然無(wú)法令人滿意［4-5］。深入了解結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找預(yù)后分子標(biāo)志對(duì)于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的早期預(yù)測(cè)與個(gè)體化治療策略的制定具有極為重要的臨床意義。

目前，腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，并對(duì)化療藥物產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一［6］。作為一種腸道成體干細(xì)胞的標(biāo)記物之一，富含亮氨酸重復(fù)單位的G蛋白耦聯(lián)受體5（Leucine-rich，repeat-containing，G-proteinecoupled receptor 5，LGR5）具有特異性的干細(xì)胞活性［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)LGR5是Wnt信號(hào)通路的靶基因之一，而LGR5+結(jié)腸干細(xì)胞可在Wnt通路異常激活的情況下逐漸形成增殖的腺瘤，提示LGR5可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生扮演著至關(guān)重要的角色［9］。另一方面，近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明腫瘤免疫微環(huán)境改變直接參與了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的調(diào)控［10］。集落刺激因子1受體（colony-stimulating factor 1 receptor，CSF1R）是蛋白酪氨酸激酶受體家族的一員，作為免疫系統(tǒng)中的重要調(diào)節(jié)因子，CSF1R可以通過(guò)旁分泌或自分泌方式激活單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移［11-12］。近年來(lái)，有研究報(bào)道CSF1R在膠質(zhì)瘤、腎透明細(xì)胞癌、胃癌等腫瘤組織中存在明顯異常表達(dá)，其可能是這些惡性腫瘤患者的一個(gè)潛在預(yù)后因素［13-16］。然而，尚不清楚CSF1R在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)水平及其預(yù)后意義。在本研究中，我們通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)了LGR5與CSF1R在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平，通過(guò)結(jié)合患者臨床病理學(xué)特征與生存數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析，旨在探索二者的臨床意義與預(yù)后價(jià)值，力求為結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評(píng)估及分子靶向治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 樣本收集與病人的臨床資料

回顧性選取2016年2月至2019年1月南通大學(xué)附屬如皋醫(yī)院初診并行手術(shù)治療的114例結(jié)直腸癌患者為研究對(duì)象，收集腫瘤組織及癌旁組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)證實(shí)為原發(fā)性結(jié)腸或直腸腺癌；②術(shù)前未行新輔助放、化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床病理資料或隨訪數(shù)據(jù)不完整者；②隨訪時(shí)間不足1個(gè)月者。

本研究共納入結(jié)直腸癌患者114例，其中男65例，女49例；年齡37～88歲，平均年齡（64.6±12.3）歲；結(jié)腸癌76例（66.7%），直腸癌38例（33.3%）；中位腫瘤直徑為5 cm（四分位距：3.5～5.5 cm）；根據(jù)組織學(xué)類(lèi)型，高、中分化腺癌69例（60.5%），低分化腺癌45例（39.5%）；根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)TNM 分期（第7版），Ⅰ期17例（14.9%），Ⅱ期30例（26.3%），Ⅲ期34例（29.8%），Ⅳ期33例（28.9%）。

同時(shí)收集患者的一般資料及臨床病理特征，具體包括：年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、組織學(xué)類(lèi)型、腫瘤浸潤(rùn)深度（T分期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M分期）、淋巴血管侵犯等。結(jié)直腸癌TNM分期參照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)第7版。本研究已通過(guò)南通大學(xué)附屬如皋醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的審核，所有參與者已簽署知情同意書(shū)，告知手術(shù)標(biāo)本的使用目的。

1.2 免疫組化

將收集的結(jié)直腸癌組織樣本通過(guò)石蠟包埋、固定并連續(xù)切片后，置于二甲苯和梯度酒精中分別進(jìn)行脫蠟與水化處理。接下來(lái)，將組織切片置于檸檬酸鹽緩沖液（pH值7.4）中進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫，使用3% H2O2浸泡15 min，以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。使用1%胎牛血清封閉組織切片后，分別加入LGR5抗體（Abcam公司）與CSF1R抗體（Abcam公司）于4℃下孵育過(guò)夜。次日，使用PBS緩沖液將組織切片清洗干凈，分別加入生物素標(biāo)記的二抗，于室溫下繼續(xù)孵育30 min，加入適量DAB顯色，蘇木素復(fù)染。免疫組化染色陽(yáng)性的判定方法如下：根據(jù)染色強(qiáng)度，無(wú)染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；染色陽(yáng)性細(xì)胞的比例小于5%（每高倍視野下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞）計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)為3分，大于75%計(jì)4分。基于染色強(qiáng)度與染色陽(yáng)性細(xì)胞比例積分的乘積，計(jì)算免疫組化總評(píng)分，將0～4分定義為陰性表達(dá)，大于4分定義為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 隨訪

所有接受手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者均在術(shù)后接受常規(guī)隨訪，總生存期（overall survival，OS）從患者手術(shù)之日起計(jì)算至因任何原因死亡。全組病人的隨訪資料完整，中位隨訪時(shí)間為39.0個(gè)月（范圍：1～61個(gè)月）。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)處理與采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或%形式表示，獨(dú)立樣本采用卡方χ2檢驗(yàn)或Fisher′s精確檢驗(yàn)；配對(duì)樣本采用McNemar檢驗(yàn)；通過(guò)Kaplan-Meier法分別繪制患者的生存曲線，生存率的比較采用Log-rank檢驗(yàn)。采用多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LGR5、CSF1R在結(jié)直腸癌樣本中的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果展示，LGR5與CSF1R蛋白在結(jié)直腸癌組織中呈明顯陽(yáng)性表達(dá)，以胞漿表達(dá)為主，呈彌漫性分布；LGR5、CSF1R在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為61.4%（n=70）和63.2%（n=72），顯著高于其在癌旁組織中的表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 LGR5與CSF1R在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)（HE，×400）A：LGR5在癌旁表達(dá)中的表達(dá)呈陰性（-）；B：LGR5在結(jié)腸癌組織中表達(dá)呈陽(yáng)性（+）；C：CSF1R在癌旁表達(dá)中的表達(dá)呈陰性（-）；D：CSF1R在結(jié)腸癌組織中表達(dá)呈陽(yáng)性（+）

2.2 LGR5、CSF1R表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

LGR5陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤直徑（χ2=4.938，P=0.026）、淋巴血管浸潤(rùn)（χ2=5.279，P=0.022）、漿膜侵犯（χ2=7.216，P=0.007）及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（χ2=5.923，P=0.015）顯著相關(guān)，見(jiàn)表1。CSF1R蛋白陽(yáng)性表達(dá)者在漿膜侵犯（χ2=9.975，P=0.002）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=3.797，P=0.048）及淋巴血管浸潤(rùn)（χ2=4.245，P=0.039）方面顯著高于陰性表達(dá)者，而在年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、組織學(xué)類(lèi)型等因素的比較上，無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表1 LGR5表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

表2 CSF1R表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 LGR5、CSF1R表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

LGR5陽(yáng)性表達(dá)者的總生存期明顯短于LGR5陰性表達(dá)者，兩組患者中位OS分別為45.1個(gè)月（95%CI：35.1～55.2個(gè)月）和56.1個(gè)月（95%CI：52.4～59.8個(gè)月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.302，P=0.038），見(jiàn)圖2A。CSF1R陽(yáng)性表達(dá)者的中位OS為42.3個(gè)月（95%CI：24.6～60.0個(gè)月），顯著低于CSF1R陰性表達(dá)者中位OS為59.2個(gè)月（95%CI：51.2～61.2個(gè)月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.610，P=0.018），CSF1R陽(yáng)性表達(dá)提示結(jié)直腸患者預(yù)后不佳，見(jiàn)圖2B。

圖2 Kaplan-Meier曲線展示LGR5（A）、CSF1R表達(dá)（B）與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

單、多變量Cox回歸分析揭示LGR5陽(yáng)性表達(dá)（HR=2.385，95% CI：1.254～4.534，P=0.008）、CSF1R陽(yáng)性表達(dá)（HR=3.652，95% CI：1.986～6.713，P=0.001）、TNM分期（HR=2.711，95%CI：1.366～5.380，P=0.004）及淋巴血管浸潤(rùn)（HR=1.940，95% CI：1.035～3.636，P=0.039）是結(jié)直腸患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，見(jiàn)表3、表4。

表3 影響結(jié)直腸患者預(yù)后的單因素Cox回歸分析

表4 影響結(jié)直腸患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討論

結(jié)直腸癌是一種具有高度生物學(xué)異質(zhì)性的惡性腫瘤，術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因。盡管血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是目前監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的常用腫瘤標(biāo)志物，但其預(yù)后價(jià)值依然有限。尋找、發(fā)現(xiàn)新型分子標(biāo)志物對(duì)結(jié)直腸癌患者的早期診斷、預(yù)后評(píng)估及個(gè)體化治療方案的制定具有重要的臨床意義。在本研究中，我們通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)了LGR5與CSF1R蛋白在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)水平及其預(yù)后意義。值得注意的是，我們的研究結(jié)果表明LGR5與CSF1R的表達(dá)可以作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后不佳的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

LGR5一直被認(rèn)為是胃腸道干細(xì)胞的重要標(biāo)志之一，既往研究表明LGR5+細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新、自我分化及增殖能力，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著腫瘤干細(xì)胞的角色［17-18］。Jang等［19］研究展示LGR5在人結(jié)直腸癌前病變，特別是絨毛管狀腺瘤中明顯高表達(dá)，推測(cè)人類(lèi)絕大多數(shù)結(jié)直腸癌可能是從LGR5+細(xì)胞發(fā)展而來(lái)。我們的結(jié)果進(jìn)一步表明，LGR5在結(jié)直腸癌樣本中呈明顯陽(yáng)性表達(dá)，分析其與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系后，發(fā)現(xiàn)LGR5陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴血管浸潤(rùn)、腫瘤漿膜侵犯及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，是結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后變量。這些發(fā)現(xiàn)提示LGR5是腫瘤惡性表型的潛在標(biāo)志，其可能作為一個(gè)癌基因促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。既往研究的結(jié)果亦支持了我們的發(fā)現(xiàn)，證實(shí)了LGR5表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期等因素的相關(guān)性及其預(yù)后價(jià)值［20-24］。Gzil等［24］報(bào)道LGR5在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)92.0%，且與血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。另一方面，分子生物學(xué)的證據(jù)表明，LGR5表達(dá)上調(diào)抑制了N-cadherin、Snail、Slug等細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步增加了腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的潛能［22，25］。此外，LGR5還可能通過(guò)激活其下游的Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展［26-27］。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明LGR5或許是結(jié)直腸癌治療的一個(gè)有價(jià)值的靶點(diǎn)。

CSF1R主要與集落刺激因子1（Colony-stimulating factor 1，CSF1）形成信號(hào)軸調(diào)控單核-巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)與活性，通過(guò)形成特定腫瘤微環(huán)境，介導(dǎo)免疫抑制，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移［28］。作為一種跨膜受體，CSF1R的異常表達(dá)已在胃癌、鼻咽癌及腎透明細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中有所報(bào)道。Yang等［13］研究結(jié)果展示CSF1R在腎透明細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，其陽(yáng)性表達(dá)與T分期、N分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈明顯正相關(guān)，CSF1R是患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。Okugawa等［14］通過(guò)免疫組化染色評(píng)估了148例胃癌組織中CSF-1R的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSF-1R在胃癌樣本中呈明顯高表達(dá)，生存分析表明高表達(dá)者死亡與疾病復(fù)發(fā)進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)分別是低表達(dá)者的1.38倍與1.79倍。后續(xù)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)上調(diào)CSF-1R表明明顯促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的增殖、遷移與抗凋亡能力［14］。然而，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于CSF-1R在結(jié)直腸癌中表達(dá)及其預(yù)后意義的相關(guān)報(bào)道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌樣本中CSF-1R的陽(yáng)性表達(dá)率為63.2%，顯著高于癌旁組織；CSF-1R高表達(dá)者具有漿膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴血管浸潤(rùn)等特點(diǎn)，預(yù)示患者預(yù)后不佳。在今后的研究中，我們擬進(jìn)一步開(kāi)展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以明確CSF-1R對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

綜上所述，本研究結(jié)果表明LGR5與CSF1R在結(jié)直腸癌中呈明顯陽(yáng)性表達(dá)，并與腫瘤惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，二者是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不佳的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了LGR5與CSF1R在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的致癌作用，為腫瘤臨床治療提供了新的思路。