鄭天明，梁鴻章，胡蓉，安尼瓦爾·買買提

食管癌是全球常見的腫瘤之一，發(fā)病率位居第八，死亡率位居癌癥相關(guān)死亡的第六位。在中國，食管癌患者的1年和5年生存率分別為50%及15%［1］。食管癌的臨床治療仍然具有挑戰(zhàn)性，提高臨床治療效果需要深入研究相關(guān)分子生物學機制以及多學科聯(lián)合治療［2］。

核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（The nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路主要由NF-κB二聚體、I-κB調(diào)節(jié)因子和IKK復合物構(gòu)成，參與眾多生物學過程，包括免疫調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)發(fā)育、炎癥反應以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等［3］。文獻報道NF-κB在食管癌中發(fā)揮著重要的促癌作用，參與腫瘤的增殖［4］、侵襲［5］、腫瘤血管形成［6］、凋亡抵抗［7］，同時也是食管癌潛在的治療靶點之一。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-21同樣具有促進食管癌的作用，包括促進腫瘤的侵襲［8］、抵抗凋亡［9］，且與食管癌的不良預后存在臨床正相關(guān)［10］。NF-κB在不同的疾病模型中通過調(diào)控miR-21發(fā)揮促進腫瘤的作用，如調(diào)控腎癌的增殖［11］、抑制黑色素瘤凋亡［12］等等。目前關(guān)于NF-κB和miR-21在食管癌中的作用以及相互調(diào)控研究甚少，本課題將初步研究食管癌中NFκB對食管癌細胞增殖及凋亡的作用，以及NF-κB對miR-21、PTEN（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten）表達的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 ET-10人食管癌細胞株購于美國ATCC。

1.1.2 細胞實驗相關(guān)試劑 DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、100 U/mL青霉素+鏈霉素、lipofactemine3000、Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒均購自美國Invitrogen公司；脂多糖（LPS，Lipopolysaccharide）購自美國MCE 公 司；一 抗（抗cleaved caspase3、抗GAPDH、抗PTEN）、二抗均購自美國abcam公司；CCK-8細胞增殖能力檢測試劑盒購自日本Dojindo公司；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒均購自美國Pierce公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；引物合成項目均購自上海生工生物工程股份有限公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT Reagent Kit）、real-time PCR試劑盒（SYBR Premix Ex Taq II）均購自日本Takara公司；shRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) ET-10人食管癌細胞株培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，并添加1U/mL青霉素+鏈霉素。

1.2.2 shRNA轉(zhuǎn)染 本文所涉及shRNA靶序列如下：shRNA-NC，GTTCTCCGAACGTGTCACGT；shRNA-NF-κB-p65-1，GCCCTATCCCTTTACGTCA；shRNA-NF-κB-p65-2，GCCCT ATCCCTTTACGTCA。使用Lipofactemine3000進行shRNA轉(zhuǎn)染，詳細步驟參考產(chǎn)品說明書，72h后進行后續(xù)實驗，包括抽提RNA、CCK-8細胞增殖檢測、流式細胞術(shù)檢測凋亡以及提取蛋白。

1.2.3 細胞RNA抽提及qRT-PCR 使用TRIzol法提取細胞RNA并檢測濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進一步進行qRT-PCR。qRT-PCR程序使用產(chǎn)品說明書推薦程序。本實驗涉及引物序列如下：GAPDH，F(xiàn)-5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，R-5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′；NF-κB，F(xiàn)-5′-GGGACTAT GACTTGAATGCGGTCC-3′，R-5′-CAGGTCCCGTGAAATACACC TCAA-3′；miRNA-21，F(xiàn)-5′-ACACTCCAGCTTAGTGCTTATCAGA CTGA-3′，R-5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′。以GAPDH作為內(nèi)參，并使用2-ΔΔCt值計算靶基因的相對表達量。

1.2.4 CCK-8細胞增殖活力檢測 ET-10細胞接種于96孔板后使用lipo3000進行shRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染第4天參照說明書進行細胞增殖能力檢測或使用10μM LPS處理48 h后檢測細胞增殖能力。簡要步驟如下，每孔加入10μL CCK-8后37℃孵育1 h，酶標儀檢測A490 nm處的吸光度值。細胞增殖抑制率=（1-shRNA-NF-κB平均吸光度值）/（shRNA-NC平均吸光度值-空白孔平均吸光度值）×100%。

1.2.5 Annexin-V/PI凋亡檢測 ET-10轉(zhuǎn)染shRNA或使用10μM LPS后，于72 h收集上清及細胞，Annexin-V-FITC/PI染色步驟詳見產(chǎn)品說明書。避光并使用流式細胞儀進行檢測，本課題所統(tǒng)計細胞總凋亡率=早期凋亡率（Annexin-VFITC+/PI-）+晚期凋亡率（Annexin-V-FITC+/PI+）。

1.2.6 細胞蛋白抽提及Western blotting實驗 使用RIPA提取細胞總蛋白，BCA法蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳。使用PVDF膜濕轉(zhuǎn)法進行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜后加入相應種屬的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h后使用ECL發(fā)光法檢測蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學分析、制圖，數(shù)據(jù)以表示，兩樣本均數(shù)比較均采用t檢驗，P＜0.05認為具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB調(diào)控食管癌細胞系ET-10的增殖能力

qRT-PCR的結(jié)果顯示，與對照組相比，shRNA-NF-κB-1和2分別下調(diào)NF-κB p65的表達量（83.0±3.6）%與（88.3±3.1）%，且具有統(tǒng)計學差異（P＜0.001，n=3，圖1A）。CCK-8細胞增殖能力檢測結(jié)果示，shRNA-NF-κB-1和2分別可減少ET-10細胞增殖能力（22.3±2.5）%與（31.7±2.1）%，并具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，n=3，圖1B）。CCK-8細胞增殖能力檢測結(jié)果示，500 ng/mL LPS可以促進ET-10細胞的增殖活力（21.±2.3）%，并具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，n=3，圖1C）。

圖1 NF-κB調(diào)控食管癌細胞系ET-10的增殖能力 A：使用qRT-PCR檢測對照組及shRNA敲低組中NF-κB的相對表達量的變化；B、C：使用CCK-8檢測敲低ET-10細胞中NF-κB的表達或使用LPS激活NF-κB后對于腫瘤細胞增殖能力的影響。***P＜0.001

2.2 NF-κB調(diào)控食管癌細胞系ET-10的凋亡及cleavedcaspase3表達

為進一步檢測NF-κB對于ET-10細胞抗凋亡能力的影響，使用Annexin-V-FITC/PI進行染色并使用流式細胞術(shù)進行檢測。實驗結(jié)果顯示，對照組細胞的凋亡率為（6.7±3.1）%，而敲低NF-κB表達后ET-10細胞的凋亡率上升至（16.3±3.2）%及（15.0±2.6）%，并具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，n=3，圖2A）。而與對照組相比，500 ng/mL LPS并不顯著影響ET-10細胞的凋亡情況（n=3，圖2B）。進一步Western blotting結(jié)果顯示，使用shRNA敲低NF-κB表達后分別可上調(diào)ET-10細胞中凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase3的表達（3.4±0.2）倍及（2.6±0.2）倍（P＜0.05，n=3，圖2C）。

圖2 NF-κB調(diào)控食管癌細胞系ET-10的凋亡及cleaved-caspase3表達 A，B：經(jīng)Annexin-VFITC/PI染色后使用流式細胞術(shù)檢測細胞的總凋亡率；C：使用Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase3的表達。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

2.3 NF-κB調(diào)控ET-10細胞中miRNA-21的表達

為進步探究ET-10細胞中NF-κB對具有調(diào)控凋亡作用的miR-21的影響，本部分使用qRT-PCR檢測在ET-10細胞中敲低NF-κB表達或經(jīng)LPS處理后后miR-21表達量的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，敲低NF-κB表達后可分別下調(diào)ET-10細胞中miR-21的表達（22.3±2.5）%（P＜0.01，n=3）與（31.7±2.1）%（P＜0.001，n=3），并具有統(tǒng)計學差異（圖3A）。與對照組相比，500 ng/mL LPS處理72 h后，ET-10細胞中miR-21的表達量上調(diào)（23.3±4.9）%（P＜0.01，n=3），并具有統(tǒng)計學差異（圖3B）。

圖3 NF-κB調(diào)控ET-10細胞中miRNA-21的表達 qRTPCR檢測敲低ET-10中NF-κB的表達或使用LPS處理后對于miR-21的影響。**P＜0.01；***P＜0.001

2.4 NF-κB調(diào)控ET-10細胞中miR-21靶基因PTEN的表達

Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，在ET-10細胞中使用shRNA敲低NF-κB的表達后，分別可抑制PTEN蛋白表達（74.0±3.1）%（P＜0.01，n=3）及（75.7±2.3）%（P＜0.001，n=3），具有統(tǒng)計學意義（圖4A）。LPS可以顯著促進ET-10細胞中PTEN蛋白表達（2.8±0.2）倍（P＜0.001，n=3），具有統(tǒng)計學意義（圖4B），表明PTEN是眾多細胞凋亡調(diào)控蛋白之一，發(fā)揮著抑制凋亡的作用，同時也是miR-21的靶基因之一。

圖4 NF-κB調(diào)控ET-10細胞中miR-21靶基因PTEN的表達Western blotting檢測敲低ET-10細胞中NF-κB或LPS處理后對于PTEN表達的影響。**P＜0.01；***P＜0.001

3 討論

本課題發(fā)現(xiàn)，在食管癌中NF-κB促進腫瘤細胞增殖并產(chǎn)生凋亡抵抗，下調(diào)NF-κB表達可促進食管癌細胞系ET-10發(fā)生凋亡。同時NF-κB對于miR-21及其靶基因凋亡相關(guān)蛋白PTEN存在調(diào)控作用。

眾多研究報道NF-κB在食管癌中發(fā)揮著促侵襲轉(zhuǎn)移、增殖以及血管新生等作用，并受多種分子的調(diào)控，包括miRNA、LncRNAs、circRNAs等等。文獻報道，在食管鱗狀細胞癌中，miR-145-5p的表達呈下降趨勢，Mei等進一步利用microRNA微陣列和GEO數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus）證實miR-145-5p通過調(diào)控NF-κB p65的表達，從而促進食管癌細胞的遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）［14］。長鏈非編碼RNA（Long non-protein coding RNA，LncRNA）指長度大于200核苷酸的非編碼RNA，在腫瘤中發(fā)揮著重要的生物學作用。Yang等人報道在食管癌中，LncRNA-FTH1P3（ferritin heavy chain 1 pseudogene 3）促進NF-kB p65的表達并進一步促進細胞的增殖、遷移和侵襲能力［15］。PLCE1（phospholipase C epsilon-1）被認為是食管鱗狀細胞癌的易感基因，Chen等發(fā)現(xiàn)食管癌中PLCE1的低甲基化通過激活PI/PLCε/NF-κB信號通路、促進VEGF-C/Bcl-2的表達可誘導腫瘤血管形成，進一步促進了食管癌的增殖及轉(zhuǎn)移［6］。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子，主要位于細胞質(zhì)或儲存于外泌體中。研究發(fā)現(xiàn)，circC3P1與miR-21之間存在互相拮抗的作用，腎癌中高表達的miR-21拮抗具有抑癌作用的circC3P1并促進腫瘤的PI3K/AKT/NF-kB信號通路、減弱凋亡抑制蛋白PTEN的作用，促進腫瘤細胞的增殖、一直凋亡、促進轉(zhuǎn)移能力?？梢?，NF-κB受到多種分子機制的調(diào)控，發(fā)揮著促進腫瘤的作用，故以其為靶點的研究為食管癌的治療帶來了新的希望。許多小分子化合物均可以通過抑制NF-κB發(fā)揮抑制食管癌的作用，如連翹甙元被報道可通過線粒體凋亡途徑、促進ROS生成、抑制NF-κB信號通路，在體外和體內(nèi)殺傷人食管癌耐藥細胞株SH-1-V1［17］。本課題研究同樣發(fā)現(xiàn)，下調(diào)食管癌細胞中NF-kB p65的表達可以miR-21/PTEN信號通路促進腫瘤細胞的凋亡，未來的研究將進一步研究食管癌細胞中維持NF-kB異常激活的機制以及將其作為靶點促進食管癌細胞凋亡的相關(guān)研究。另外，也需要更多的更多的臨床證據(jù)來證實腫瘤組織中NF-kB p65、miR-21與PTEN表達量之間的相關(guān)性，判斷是否具有作為預后判斷指標的價值。

miRNA是長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，起到轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控的作用。miR-21在食管癌中發(fā)揮著類似于癌基因的作用，Zhao等報道m(xù)iR-21在食管癌組織中高表達，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低生存率存在臨床正相關(guān)［13］。進一步試驗發(fā)現(xiàn)，miR-21通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白從而使食管癌細胞產(chǎn)生失巢凋亡（anoikis）抵抗，利于腫瘤的生存以及遠處轉(zhuǎn)移。另外，在卵巢癌［18］、直腸癌［19］、肺癌［20］、前列腺癌［21］中，miR-21同樣可以調(diào)控PTEN的表達，并促進腫瘤的增殖以轉(zhuǎn)移。本課題發(fā)現(xiàn)，通過shRNA下調(diào)NF-κB p65的表達可以下調(diào)miR-21以及PTEN的表達并促進食管癌細胞發(fā)生凋亡。有許多文獻也支持我們的發(fā)現(xiàn)，即NF-κB對于miR-21具有正向調(diào)控作用，如在腎癌［11］、骨髓瘤［12］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤［22］、胰腺β細胞［23］等。NF-κB/miR-21信號通路調(diào)控著下游眾多基因的表達，除了PTEN，研究較多的還有PDCD4（recombinant human progrmammed cell death protein 4）。PDCD4是miR-21下游的靶基因之一，miR-21負向調(diào)控食管癌中PDCD4的表達并促進腫瘤細胞對順鉑的耐藥［24］。研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ期食管癌中，與癌旁組織相比，腫瘤組織中的miR-21表達量增高，而PDCD4的表達量下降，且與腫瘤的TMN分級、患者的總生存期、無進展生存期相關(guān)。進一步的研究將同時關(guān)注NF-κB/miR-21對下游基因的調(diào)控作用，并探索放化療對其的影響。

綜上所述，NF-κB在食管癌中發(fā)揮著癌基因的作用，并通過miR-21/PTEN促進食管癌細胞產(chǎn)生凋亡抵抗、維持生存。NF-κB可作為食管癌治療的潛在靶點，但需要進一步的體內(nèi)及體外實驗加以驗證其上下游的分子調(diào)控機制，以利于從多方面抑制其促癌的作用。本課題提出在食管癌中NF-κB可通過microRNA發(fā)揮對下游靶基因的調(diào)控作用，為進一步的研究提供了理論基礎(chǔ)。