莊康敏，林志昭，孟琰

肝局灶性結(jié)節(jié)性增生（focal nodular hyperplasia，F(xiàn)NH）是一種常見的肝臟良性病變，也被定義為一種特殊的組織學(xué)表現(xiàn)［1-3］。FNH分為兩類：經(jīng)典型和非經(jīng)典型。經(jīng)典FNH通常表現(xiàn)為一種堅(jiān)固、邊界清晰、無包膜的病變，伴有增生性肝實(shí)質(zhì)結(jié)節(jié)，其中含有纖維基質(zhì)，可形成特征性星狀疤痕［4］。相比之下，非經(jīng)典型FNH很少有中央疤痕。

中央星狀瘢痕是經(jīng)典FNH的典型病理和影像學(xué)特征。先前的影像學(xué)診斷研究表明，通過腹部超聲、CT和MRI掃描，近85%的FNH患者可以觀察到中央瘢痕的形成［5］。中央瘢痕的影像學(xué)特征的描述和細(xì)節(jié)，以及對(duì)整個(gè)病變的全面評(píng)估，可以提高FNH的診斷效率。

關(guān)于經(jīng)典FNH中中央瘢痕的起源，目前研究較少。先前存在的血管異常已被證明是FNH［10-11］的根本原因。動(dòng)脈期的腹部超聲、CT和MRI掃描證實(shí)了動(dòng)脈過度融合。這種超融合被認(rèn)為是導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)增生，并最終導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞（HSC）的激活［12-13］。HSC是導(dǎo)致肝纖維化的最重要細(xì)胞［14］?；罨腍SC可分泌I型膠原，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）［15］的沉積。HSCs激活現(xiàn)象可能是經(jīng)典FNH中心瘢痕形成的主要原因，但更多細(xì)節(jié)有待證實(shí)。

因此，關(guān)于經(jīng)典FNH中心瘢痕形成的更多信息仍然未知。在這里，我們進(jìn)行了一項(xiàng)有趣的研究，以了解更多關(guān)于中央瘢痕的形成機(jī)制。我們從細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)水平建立了一種新的方法，用以研究中央瘢痕型FNH，并探討HSC在中央瘢痕形成中的作用，以期為經(jīng)典型FNH的形成提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 肝星狀細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

收集我院肝膽外科手術(shù)獲得的肝臟組織進(jìn)行新鮮HSC的分離及培養(yǎng)工作。操作時(shí)根據(jù)經(jīng)典的二步法對(duì)肝星狀細(xì)胞進(jìn)行分離，主要步驟包括：通過原位灌注膠原酶和蛋白酶從肝臟分離非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。HSC通過不連續(xù)的兩層Nycodenz梯度（11.4%和17%；Sigma，St.Louis，MO）與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞分離，接著將分離的HSC接種在涂有5μg/cm2鼠尾I型膠原（GIBCO Brl，Rockville，MD）的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)［16-18］。所有患者均提供了書面同意書，同意參與該研究，且該方案得到了南方醫(yī)科大學(xué)機(jī)構(gòu)倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。本研究符合《赫爾辛基宣言》標(biāo)準(zhǔn)和現(xiàn)行道德準(zhǔn)則。

1.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

對(duì)分離后2 h、2 d和7 d的細(xì)胞，用奧林巴斯倒置顯微鏡（Olympus，Japan）進(jìn)行相位顯微鏡觀察。從FNH分離的HSC的離心聚集物中獲得透射電子顯微鏡（TEM）照片。培養(yǎng)2 d后，將原代FNH分離的HSC消化，并以1 200 rpm離心5 min。固定時(shí)，將2.5%的戊二醛置于0.1 M醋酸鈉中過夜。細(xì)胞在水中用1%四氧化鋨固定1 h，并在丙酮中脫水。然后，將細(xì)胞包埋在樹脂中。切片并用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色后，使用日立H-7500電子顯微鏡拍照。

1.3 免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞在24孔培養(yǎng)皿玻璃蓋玻片培養(yǎng)約30%密度后用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）沖洗細(xì)胞3次。然后將細(xì)胞固定在4%多聚甲醛的PBS中10 min，在PBS中洗滌，并用含有0.1%Triton X-100的PBS滲透20min。載玻片在封閉液（5%牛血清白蛋白的PBS溶液）中孵育30 min。Desmin蛋白（CST），兔多克隆抗α-SMA（Abcam）、兔多克隆抗MMP-2（Sigma-Aldrich）和兔多克隆抗I型膠原（Abcam）均在封閉液中以1∶200稀釋，并在4℃下與細(xì)胞一起孵育過夜。第2天，用PBS洗滌細(xì)胞3次，10 min/次后使用二抗、DAPI染色后于熒光顯微鏡下觀察圖像。

1.4 組織標(biāo)本免疫組化實(shí)驗(yàn)

收集南方醫(yī)院近年來經(jīng)外科手術(shù)確診為FNH的28例組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用大體形態(tài)學(xué)檢查和放射學(xué)檢查確定中央瘢痕的存在。切片后經(jīng)脫蠟、洗滌、一抗二抗孵育、封閉、DAB染色等步驟完成免疫組化工作。所用一抗為兔多克隆抗I型膠原（Proteintech，在封閉溶液中以1∶200稀釋）、兔多克隆抗α-SMA（Abcam，在封閉溶液中以1∶200稀釋）及α-微管蛋白（中國北京中山生物科技公司，在封閉溶液中以1∶4 000稀釋）。

1.5 雙重免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)

使用FNH組織切片標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。石蠟標(biāo)本依次經(jīng)切片、脫蠟、洗滌后進(jìn)行抗體孵育。一抗孵育為將載玻片與兔多克隆抗I型膠原（Proteintech，芝加哥，美國）在封閉溶液中以1∶200稀釋，并與小鼠多克隆抗I型膠原在4℃下孵育過夜，α-SMA（中國武漢博斯特）在封閉溶液中以1∶100稀釋。遂后在PBS中洗滌30 min后，在37℃下使用熒光二體，包括Cy3山羊抗兔IgG（EarthOx）和Fluor 488山羊抗小鼠IgG（中山生物科技），均在封閉溶液中以1∶100稀釋。切片用DAPI（Life Technologies）染色，并用NikonEclipse E600熒光顯微鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（S.E.M.）表示。t檢驗(yàn)用于比較經(jīng)典型與非經(jīng)典型FNH兩組間中央瘢痕直徑的差異。卡方檢驗(yàn)用于揭示中央瘢痕的存在與病變直徑之間的關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果

2.1 FNH分離的HSC具有肌成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征

如圖1所示，在48 h內(nèi)首次觀察到90%的細(xì)胞呈紡錘形。然后，我們獲得了具有肌成纖維細(xì)胞梭狀形態(tài)的融合細(xì)胞，而光鏡下無法觀察到細(xì)胞質(zhì)中存在脂滴的證據(jù)。第2天掃描HSC的TEM顯示肌成纖維細(xì)胞特征。在沒有脂滴的細(xì)胞質(zhì)中可以觀察到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌絲（圖2），表明HSC最初可能在組織中被激活。這些形態(tài)學(xué)特征表明，從具有中央瘢痕組織的FNH中分離活化HSC的方法是有用的。

圖1 新鮮經(jīng)典FNH組織分離的肝星狀細(xì)胞呈現(xiàn)出成纖維細(xì)胞樣形態(tài)

圖2 培養(yǎng)第7天肝星狀細(xì)胞顯示出豐富的粗面ER和微絲結(jié)構(gòu)（箭頭）（TEM，×5000）

2.2 FNH分離的HSC高表達(dá)特異性HSC標(biāo)記物

將FNH分離的HSC細(xì)胞進(jìn)行α-SMA、I型膠原和MMP-2染色，可見這3種蛋白均顯著表達(dá)，提示FNH激活的HSC中高度表達(dá)細(xì)胞骨架和ECM蛋白（圖3）。FNH分離的HSC中I型膠原的表達(dá)表明，它可能是經(jīng)典FNH的主要ECM成分，并可能導(dǎo)致FNH纖維化，形成特征性中心瘢痕。此外，激活過程中膠原合成的上調(diào)是參與肝纖維化的星狀細(xì)胞最顯著的分子反應(yīng)之一。

圖3 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)培養(yǎng)第7天的肝星狀細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)ECM蛋白和細(xì)胞骨架標(biāo)志物 A：α-SMA；B：Desmin蛋白；C：I型膠原蛋白；D：MMP-2

2.3 經(jīng)典型FNH組織高表達(dá)HSC特異性標(biāo)記α-SMA及I型膠原

經(jīng)典FNH組織的中央瘢痕和纖維間隔顯示α-SMA的強(qiáng)染色，而在沒有中央瘢痕的組織中，僅中央小靜脈可見α-SMA染色。這一現(xiàn)象提示經(jīng)典FNH組織的中央瘢痕區(qū)域存在活化的HSC細(xì)胞（圖4 A，B），I型膠原沉積主要發(fā)生在中央瘢痕周圍，可以觀察到含有I型膠原的細(xì)胞（圖4D）。所有無中央瘢痕的FNH病例均未發(fā)現(xiàn)特異性染色（圖4C）。雙重免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)典型FNH組織中央瘢痕區(qū)域中，α-SMA與I型膠原蛋白存在共表達(dá)現(xiàn)象（圖5），從組織學(xué)水平證實(shí)了α-SMA特異性表達(dá)的HSC細(xì)胞具有分泌I型膠原蛋白的能力。

圖4 免疫組化顯示蛋白水平上α-SMA在中央瘢痕型（A，B）及無中央瘢痕型FNH（E，F(xiàn)）中的表達(dá)情況；I-Collagen在中央瘢痕型（C）及無中央瘢痕型FNH（D）中的表達(dá)情況

圖5 雙重免疫熒光染色顯示在經(jīng)典型FNH組織中α-SMA和I-Collagen的共表達(dá)現(xiàn)象

2.4 中央瘢痕及其特異性標(biāo)記物α-SMA及I型膠原的表達(dá)程度與與經(jīng)典型FNH的大小關(guān)系密切

我們進(jìn)一步探討不同病理類型FNH組織標(biāo)本中中央瘢痕的與病變的關(guān)系。如表1所示，在19例確診為中央瘢痕的病灶中，病灶的平均大小為（4.7±2.8）cm，而非中央型FNH病灶的平均大小為（2.4±0.3）cm，兩者存在顯著差異（P=0.013）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在所有28個(gè)FNH組織標(biāo)本中，有19個(gè)標(biāo)本有中央疤痕，并且在大病灶（＞3 cm，13個(gè)病灶中的12個(gè)）中比在小病灶（＜3 cm，15個(gè)病灶中的7個(gè)，P=0.011）中更常見。在有中央瘢痕的21個(gè)FNH組織中，有α-SMA激活的HSC和I型膠原在小面積病變（圖6 B，D）和大面積病變（圖6A，C）之間顯示出顯著差異，提示分泌I型膠原的活化HSCs參與中央瘢痕的形成，同時(shí)隨著纖維化程度的加重而表達(dá)活化程度增加。

表1 經(jīng)典型及非經(jīng)典型FNH的主要特征

圖6 免疫組化顯示α-SMA及I-Collagen在大面積中央瘢痕型FNH（B，D）及小面積中央瘢痕型FNH（A，C）中的表達(dá)存在顯著差異

3 討論

既往對(duì)FNH的研究主要集中在影像學(xué)表現(xiàn)和病理類型［2-3］。中央瘢痕是診斷FNH的關(guān)鍵特征，而中央瘢痕的形成尚不清楚。我們?cè)诒狙芯恐袕募?xì)胞和組織學(xué)水平建立了一種新的細(xì)胞組織學(xué)模型以探討中央瘢痕的形成。

雖然已有文獻(xiàn)報(bào)道了分離人HSC的方法，但由于新鮮手術(shù)切除的FNH標(biāo)本極為少見，迄今尚無從FNH組織中成功分離和培養(yǎng)原代HSC的研究報(bào)告。在這項(xiàng)研究中，我們獲得了通過經(jīng)典程序分離的細(xì)胞，這些細(xì)胞具有FNH中心瘢痕中活化HSC的表型特征。正如我們所預(yù)期的，F(xiàn)NH分離的HSC在細(xì)胞培養(yǎng)過程中顯示出肌成纖維細(xì)胞樣特征。此外，據(jù)報(bào)道，軟膠原基質(zhì)可阻止成纖維細(xì)胞分化為肌纖維母細(xì)胞［19-20］。有意思的是，培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，在涂有I型膠原的塑料組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的FNH分離的HSC仍然顯示出顯著的活化HSC特征，包括基質(zhì)生成，以及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌絲的存在，這與從肝硬化組織中報(bào)道的相似［21］。目前的研究表明，HSC在分離前可能已在FNH和中央瘢痕組織中被激活。

表2 病灶大小與中央瘢痕的相關(guān)性比較［n（%）］

此外，我們還研究了培養(yǎng)的人FNH分離的HSC的細(xì)胞骨架和ECM成分的表達(dá)。我們的數(shù)據(jù)提供了證據(jù)，證明培養(yǎng)的FNH分離的HSC表達(dá)特定的細(xì)胞骨架蛋白，結(jié)蛋白，α-SMA和MMP-2（第2天）。結(jié)蛋白被定義為HSC的特異性細(xì)胞骨架標(biāo)記物，尤其是在激活狀態(tài)［22-23］。此外，強(qiáng)烈的α-SMA和MMP-2已被用作活化HSCs［24-26］的分子標(biāo)記。在ECM蛋白中，通過蛋白質(zhì)和mRNA水平檢測(cè)I型膠原。應(yīng)該指出的是，I型膠原已被證實(shí)是纖維化后期最重要的ECM沉積蛋白［27］。

從組織學(xué)檢查獲得的數(shù)據(jù)證實(shí)了HSC在中央瘢痕形成中的關(guān)鍵作用。在所有28例FNH患者中，中央瘢痕的出現(xiàn)和檢出率均高于小病灶，提示中央瘢痕的形成可能與病灶的大小有關(guān)，病灶直徑越大，中央瘢痕出現(xiàn)的概率越高。

我們的研究集中在細(xì)胞的組織學(xué)表達(dá)上α-有或無中央瘢痕的FNH樣本中的SMA和I型膠原。我們發(fā)現(xiàn)了α-SMA激活中央瘢痕區(qū)域的HSC，并表達(dá)沉積I型膠原，而僅有1例標(biāo)本檢測(cè)出了α-SMA的表達(dá)而非中央瘢痕型FNH。此外，大的經(jīng)典型FNH病灶顯示更多的α-SMA陽性的HSC和I型膠原沉積，相比之下小的病灶中，α-SMA及I型膠原的陽性表達(dá)率要更低，這表明在小病灶中央瘢痕形成的晚期，I型膠原沉積較少。這項(xiàng)研究與先前的研究結(jié)果一致，其中，大病灶比小病灶更容易觀察到中央瘢痕［28］。此外，我們使用雙重免疫熒光標(biāo)記法來確認(rèn)I型膠原在細(xì)胞中的表達(dá)α-SMA陽性HSC，提示HSC活化后確實(shí)有分泌I型膠原的能力。有趣的是，我們從細(xì)胞水平進(jìn)行的研究與組織學(xué)基礎(chǔ)一致，這進(jìn)一步證明了HSC通過分泌I型膠原，在中央瘢痕形成中的關(guān)鍵作用。

總之，我們成功地使用了一種簡(jiǎn)單的細(xì)胞組織學(xué)方法來證明活化的HSC參與到經(jīng)典型FNH中央瘢痕形成的過程。雖然我們的模型不能用于研究與中心性瘢痕相關(guān)的早期事件，并且其它類型的細(xì)胞可能與中心性瘢痕形成的纖維化過程相關(guān)，但我們的研究發(fā)現(xiàn)HSCs通過分泌I型膠原，參與中央瘢痕的形成過程，可能是經(jīng)典型FNH發(fā)展過程中較為重要的病理學(xué)改變特點(diǎn)。與此同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)病灶大小在一定程度上可以預(yù)測(cè)FNH的類型，經(jīng)典型FNH往往直徑大于非經(jīng)典型FNH，這也對(duì)于臨床上通過病灶大小預(yù)測(cè)病變類型具有一定的指導(dǎo)工作。