崔照領(lǐng)，馬麗靜，殷欣欣，楊永紅，莫中福

（石家莊市婦幼保健院，1.婦產(chǎn)科，2.功能科，河北石家莊 050051）

胎兒生長受限是指胎兒出生體重低于同孕周胎兒平均體重的2 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，或低于同孕婦周胎兒正常體重的第10 百分位數(shù)，或足月分娩胎兒出生體重＜2.5 kg，與死胎、新生兒死亡、新生兒窒息等有關(guān)，嚴(yán)重影響人口質(zhì)量。因此明確胎兒生長受限發(fā)生機(jī)制，早期預(yù)測胎兒生長受限的發(fā)生至關(guān)重要[1-2]。葉酸（folic acid, FA）、維生素B12（Vitamin B12, VitB12）是組織細(xì)胞合成DNA 的重要輔酶，與胎兒的生長發(fā)育密切相關(guān)[3]。研究表明，缺乏FA、VitB12可增加發(fā)育遲緩和缺陷的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。微小RNA（microRNA, miRNA）是約21～24 核苷酸的非編碼RNA，可調(diào)控基因的表達(dá)，目前認(rèn)為人類基因組中約30%的編碼基因受到miRNA 的調(diào)控[6]。近年來報(bào)道發(fā)現(xiàn)，miRNA 與胎兒生長、肌纖維發(fā)育有關(guān)[7]。microRNA-424（miR-424）在胎兒生長受限中報(bào)道鮮見，是否與胎兒生長受限有關(guān)有待探討。可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-1（soluble fms-like tyrosine kinase receptor-1, sFlt-1）被證實(shí)與子癇發(fā)生有關(guān)，而子癇可導(dǎo)致胎兒生長受限，故推測sFlt-1可能參與了胎兒生長受限的發(fā)生，但尚需直接論證的報(bào)道[8]。鑒于此，本研究選取116 例胎兒生長受限孕婦，探討其血清miR-424 mRNA、sFlt-1 mRNA 相對表達(dá)量對FA、VitB12水平的影響及其與胎兒生長受限的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2017年1月—2019年1月在石家莊市婦幼保健院住院分娩的116 例胎兒生長受限孕婦（FGR 組）和116 例分娩正常胎兒孕婦（對照組）的臨床資料。研究對象年齡20～43 歲。兩組孕婦入組時(shí)新生兒性別構(gòu)成、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、孕周、產(chǎn)史、妊娠次數(shù)等資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 兩組孕婦臨床資料的比較 （n=116）

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：FGR 組孕婦分娩胎兒符合胎兒生長受限診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；對照組孕婦分娩胎兒正常；入組前4 周正常飲食，無FA、VitB12干預(yù)史；單胎活產(chǎn)；無酗酒、吸煙史。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并妊娠期糖尿病、高血壓者；肝內(nèi)膽汁淤積癥者；有輸血史者；合并白血病者；伴有惡性腫瘤者；心、腎等存在嚴(yán)重功能障礙者；有藥物濫用史者；合并甲狀腺功能異常者。

1.3 主要試劑、儀器

FA、VitB12電化學(xué)發(fā)光法試劑盒（瑞士羅氏公司）；PCR 試劑盒[生物工程（大連）有限公司]；引物合成（北京擎科公司）；全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光儀（Cobas8000 型，瑞士羅氏公司）；全自動(dòng)熒光定量PCR 儀（DA7600 型，廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（Uv-2550，日本島津公司）。

1.4 方法

1.4.1 血標(biāo)本采集與檢測兩組孕婦于28～32孕周采集清晨空腹肘部靜脈血5 mL，采用電化學(xué)發(fā)光法與全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光儀檢測FA、VitB12；采用qRT-PCR 檢測miR-424 mRNA、sFlt-1 mRNA 相對表達(dá)量，1.0 mL Trizol 加入0.2 mL 氯仿，震蕩混勻，4℃12 000 r/min 離心15 min，分離上清液，入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min，4℃12 000 r/min 離心10 min，可見試管底部出現(xiàn)沉淀。棄去上清液，緩慢沿離心管壁加入75%的乙醇l mL，顛倒洗滌離心管管壁，4℃12 000 r/min 離心5 min，棄去乙醇，室溫干燥RNA 沉淀，加入100 μL無酶水，充分溶解RNA，紫外可見分光光度計(jì)測定RNA 濃度。取上述RNA 3.199 μg，加入PCR 緩沖液4 μL、寡聚核苷酸引物2 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL、濃度均為2.5 mmoL 的脫氧核糖核苷三磷酸混合物4 μL、RNA 抑制劑0.5 μL，加入無RNA 酶水至20 μL進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：25℃預(yù)變性5 min，50℃變性15 min，85℃退火5 min，4℃延伸10 min，共40 個(gè)循環(huán)。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4 μL，加入正反向引物各0.4 μL、SYBR Green（熒光插入染料）/熒光素qPCR 預(yù)混液10 μL、水5.2 μL 進(jìn)行qRT-PCR。miR-424 正向引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTC CGAGGTATTCGCACTGG-3′，反向引物：5′-CGAAC GAGCAGCAATTCAATTCATG-3′；miR-424 內(nèi)參U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；sFlt-1 正向引物：5′-GGCACAAAGACCCAAAAGAA-3′，反向引物：5′-TGCTGTCAGTCCTGGTGAAG-3′； sFlt-1 內(nèi) 參GAPDH 正向引物：5′-CAAATTCAACGGCACAGTCA A-3′，反向引物：5′-TGGTGAAGACACCAGTAGACT C-3′。反應(yīng)條件：50℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 min；95℃退火30 s，60℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。繪制熔解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.4.2 胎兒生長參數(shù)的測定新生兒斷臍后即擦干胎脂、羊水，分別測量新生兒出生體重、身高、腹圍、頭圍及BMI。

1.5 觀察指標(biāo)

①胎兒出生體重、身高、腹圍、頭圍、BMI；②孕婦血清miR-424 mRNA、sFlt-1 mRNA、FA、VitB12；③血清各指標(biāo)與胎兒生長參數(shù)的相關(guān)性；④血清各指標(biāo)預(yù)測胎兒生長受限的敏感性、特異性；⑤血清miR-424 mRNA、sFlt-1 mRNA 與FA、VitB12的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法；繪制受試者工作特征（ROC）曲線。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組胎兒生長參數(shù)比較

兩組胎兒出生體重、身高、腹圍、頭圍、BMI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），F(xiàn)GR 組低于對照組。見表2。

表2 兩組胎兒生長參數(shù)比較 （n=116，±s）

表2 兩組胎兒生長參數(shù)比較 （n=116，±s）

組別FGR組對照組t 值P 值出生體重/kg 2.42±0.35 3.18±0.32 17.260 0.000身高/cm 48.17±2.04 50.02±1.85 7.235 0.000腹圍/cm 33.26±1.32 34.75±1.59 7.766 0.000頭圍/cm 31.79±1.05 33.18±1.27 9.085 0.000 BMI/（kg/m2）10.43±1.08 12.71±1.12 15.783 0.000

2.2 兩組孕婦血清各指標(biāo)比較

兩組血清miR-424 mRNA 和sFlt-1 mRNA 相對表達(dá)量以及FA 和VitB12水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），F(xiàn)GR 組miR-424 mRNA 和sFlt-1 mRNA相對表達(dá)量高于對照組，F(xiàn)A 和VitB12水平低于對照組。見表3。

表3 兩組孕婦血清各指標(biāo)比較 （n=116，±s）

組別FGR組對照組t 值P 值miR-424 mRNA 0.27±0.11 0.14±0.08 10.294 0.000 sFlt-1 mRNA 6.97±2.19 4.58±1.22 10.268 0.000 FA/（μg/L）4.25±1.42 16.88±5.01 26.123 0.000 VitB12/（ng/L）38.87±12.92 416.24±183.65 22.077 0.000

2.3 血清各指標(biāo)與胎兒生長參數(shù)的相關(guān)性

miR-424 mRNA、sFlt-1 mRNA 與胎兒出生體重、身高、腹圍、頭圍及BMI 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；FA、VitB12與胎兒出生體重、身高、腹圍、頭圍及BMI 呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表4。

表4 血清各指標(biāo)與胎兒生長參數(shù)的相關(guān)性

2.4 血清各指標(biāo)預(yù)測胎兒生長受限的效能

ROC 曲線結(jié)果顯示，miR-424 mRNA 預(yù)測胎兒生長受限的ROC 曲線下面積（AUC） 為0.790（95%CI：0.732，0.841），截?cái)嘀担?.18 時(shí)，敏感性為74.14% （95% CI：0.476，0.790），特異性為71.55% （95% CI：0.378，0.800）；sFlt-1 mRNA 預(yù)測胎兒生長受限的AUC 為0.777 （95% CI: 0.718，0.829），截?cái)嘀担?.39 時(shí)，敏感性為56.03%（95% CI：0.448，0.664），特異性為91.38%（95% CI：0.207，0.985）；FA 預(yù)測胎兒生長受限的AUC 為0.826（95% CI：0.771，0.873），截?cái)嘀怠?1.24 μg/L 時(shí)，敏感性為85.34%（95% CI：0.576，0.892），特異性為66.38%（95% CI：0.500，0.716）；VitB12預(yù)測胎兒生長受限的AUC 為0.831（95% CI：0.777，0.877），截?cái)嘀怠?55.24 ng/L 時(shí)，敏感性為85.34%（95% CI：0.322，0.948），特異性為67.24%（95% CI：0.517，0.802）；各指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測胎兒生長受限的AUC 為0.909（95% CI：0.864，0.942），截?cái)嘀禐?13.30 時(shí)，敏感性為85.34%（95% CI：0.672，0.957），特異性為82.76%（95%CI：0.767，0.905）。見圖1、2。

圖1 血清各指標(biāo)單一預(yù)測的ROC曲線

圖2 血清各指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測的ROC曲線

2.5 血清miR-424 mRNA、sFlt-1 mRNA 與FA、VitB12的相關(guān)性

血清miR-424 mRNA 與FA 和VitB12呈負(fù)相關(guān)（r=-0.583 和-0.668，均P＜0.05）；血清sFlt-1 mRNA與FA 和VitB12呈負(fù)相關(guān)（r=-0.596 和-0.681，均P＜0.05）。見圖3、4。

圖3 血清miR-424 mRNA與FA、VitB12的相關(guān)性

圖4 血清sFlt-1 mRNA與FA、VitB12的相關(guān)性

3 討論

FA 是一種水溶性維生素，參與體內(nèi)氨基酸及核酸合成，并與VitB12共同促進(jìn)紅細(xì)胞的生成[10]。VitB12是唯一含必需礦物質(zhì)的維生素，參與蛋氨酸、胸腺嘧啶等的合成，是甲基轉(zhuǎn)移酶的輔因子，并能保護(hù)FA 在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移和貯存，同時(shí)具有促進(jìn)蛋白質(zhì)的生物合成功能，缺乏時(shí)會影響嬰幼兒的生長發(fā)育[11]。目前關(guān)于FA、VitB12在胎兒生長受限領(lǐng)域的報(bào)道較多，已經(jīng)明確胎兒生長受限孕婦及胎兒臍血中FA、VitB12表達(dá)較正常孕婦與胎兒降低[12]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)充FA 可以改善胎兒畸形和生長受限[13-14]。臨床研究中亦發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充FA 可預(yù)防抽煙孕婦胎兒生長受限[15]。FA、VitB12缺乏，胸腺嘧啶核苷酸減少，DNA 合成速度減慢，并能通過上調(diào)同型半胱氨酸途徑，影響子宮胎盤血流，降低胎兒對氧、營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，從而導(dǎo)致胎兒生長受限。目前臨床上缺乏早期評估胎兒生長受限的方法，妊娠24～32 周進(jìn)行超聲檢查亦不易發(fā)現(xiàn)，臨床應(yīng)用具有一定滯后性。本研究采用ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A 預(yù)測胎兒生長受限的AUC 為0.826，VitB12預(yù)測胎兒生長受限的AUC 為0.831，具有較高的預(yù)測價(jià)值，說明當(dāng)FA 截?cái)嘀怠?1.24 μg/L時(shí)，VitB12截?cái)嘀怠?55.24 ng/L 時(shí)，有足夠的證據(jù)預(yù)測胎兒生長受限，從而為臨床早期針對性干預(yù)提供重要的參考信息。

胎盤為胎兒生長發(fā)育提供營養(yǎng)，其發(fā)育需足夠、協(xié)調(diào)的血管生長因子。血管內(nèi)皮生長因子可介導(dǎo)血管重鑄，參與以上過程，在胎盤和胎兒生長發(fā)育中扮演重要角色[16]。在妊娠中晚期，胎盤血管生成主要為分支結(jié)構(gòu)向非分支結(jié)構(gòu)變化，形成終末絨毛，即胎盤的功能單位，若血管生成異常，可導(dǎo)致妊娠期高血壓、胎兒生長受限等異常妊娠[17]。sFlt-1 是血管內(nèi)皮生長因子高親和力受體，能競爭性結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子，是血管內(nèi)皮生長因子的抑制因子[18]。本研究FGR 組sFlt-1 mRNA高于對照組，提示sFlt-1 與胎兒生長受限有關(guān)。妊娠期女性血清中sFlt-1 主要來源于胎盤組織，是一種主要的內(nèi)源性抗血管生成因子，過表達(dá)的sFlt-1競爭性結(jié)合游離的血管內(nèi)皮生長因子后，導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子水平的降低，使新生血管生成減少，滋養(yǎng)細(xì)胞合成減少，引起螺旋小動(dòng)脈管腔狹窄，降低子宮胎盤血流量，影響母胎營養(yǎng)交換，從而參與胎兒生長受限的發(fā)生[19-20]。sFlt-1 mRNA與胎兒生長各參數(shù)呈負(fù)相關(guān)，負(fù)調(diào)控胎兒的生長發(fā)育。ROC 曲線分析結(jié)果顯示，sFlt-1 mRNA 預(yù)測胎兒生長受限的AUC 為0.777，可為臨床早期預(yù)測胎兒生長受限的發(fā)生提供參考，以便于及時(shí)干預(yù)和妊娠結(jié)局的改善。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，sFlt-1 mRNA 與FA、VitB12呈負(fù)相關(guān)，說明sFlt-1 可影響FA、VitB12表達(dá)，這可能是其參與胎兒生長受限的另一機(jī)制。

miRNA 能通過與靶mRNA 3，非翻譯區(qū)的堿基配對，介導(dǎo)靶基因的降解或翻譯抑制，在基因調(diào)控、細(xì)胞增殖、分化及凋亡中起到重要作用，近年來文獻(xiàn)報(bào)道了miRNA 在胚胎發(fā)育、胚胎干細(xì)胞發(fā)育、異常妊娠結(jié)局等方面的表達(dá)，通過參與炎癥反應(yīng)、子宮內(nèi)膜植入等途徑參與人類的妊娠[21-22]。在動(dòng)物學(xué)研究中，miRNA 能通過調(diào)控血管生成、影響動(dòng)物在子宮內(nèi)發(fā)育與出生體重[23-24]。本研究顯示，F(xiàn)GR 組miR-424 mRNA 相對表達(dá)量高于對照組，提示miR-424 與胎兒生長受限有關(guān)。胎盤血管形成異常是誘發(fā)胎兒生長受限的一個(gè)主要原因。在低氧環(huán)境下，胎盤內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行增殖與分化，刺激血管形成，以增加胎兒供氧。miR-424 受血管異常形成的調(diào)控，具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，可阻礙新生血管形成，造成功能缺氧，從而參與胎兒生長受限的發(fā)生[25]。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-424 mRNA 與胎兒生長各參數(shù)呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)miR-424 負(fù)調(diào)控胎兒的生長發(fā)育。miR-424 預(yù)測胎兒生長受限的AUC 為0.790，截?cái)嘀禐椋?.18 時(shí)，敏感性為74.14%，特異性為71.55%，可為臨床預(yù)測胎兒生長受限的發(fā)生提供量化的數(shù)據(jù)參考，從而指導(dǎo)臨床干預(yù)，改善妊娠結(jié)局。且miR-424 mRNA 與FA、VitB12呈負(fù)相關(guān)，表明miR-424 還通過FA、VitB12途徑參與胎兒生長受限的發(fā)生。但受限于研究的前沿性，尚不清楚miR-424 影響FA、VitB12的詳細(xì)機(jī)制，有待后續(xù)報(bào)道的進(jìn)一步闡明。本研究不足之處在于，兩組孕婦標(biāo)本采集時(shí)間均在孕晚期，導(dǎo)致研究結(jié)果僅適用于孕晚期孕婦，而在其他孕周的孕婦中應(yīng)用效果尚不清楚，有待后續(xù)的進(jìn)一步探討。

綜上所述，胎兒生長受限孕婦血清miR-424 mRNA、sFlt-1 mRNA 呈高表達(dá)，并能通過影響FA、VitB12水平負(fù)調(diào)控胎兒生長發(fā)育，檢測該指標(biāo)有望成為預(yù)測胎兒生長受限的一個(gè)血清學(xué)方法。