簡(jiǎn)鼎，王藝穎，朱琳，李媛媛,，張光莉，陳詩(shī)懿，羅征秀*

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸科，重慶 400014

氣道上皮是呼吸系統(tǒng)抵御外界致病物質(zhì)入侵的第一道屏障[1]。Club細(xì)胞是位于氣道上皮黏膜處的細(xì)胞群，可特異性分泌Club細(xì)胞分泌蛋白(CC16)，并可充當(dāng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞參與氣道上皮的損傷修復(fù)[2-4]。Club細(xì)胞及CC16在維持氣道上皮的完整性中起關(guān)鍵作用[5-6]。研究證實(shí)，氣道上皮損傷修復(fù)異常是哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等疾病的重要發(fā)病機(jī)制[7-8]，兒童早期CC16低表達(dá)與成年人哮喘、COPD發(fā)病密切相關(guān)[9-10]，提示生命早期Club細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能異常可能是哮喘、COPD發(fā)生的重要因素。小鼠是研究Club細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的常見動(dòng)物模型。Karnati等[11]曾對(duì)小鼠Club細(xì)胞的生物學(xué)特征進(jìn)行研究，但未對(duì)出生后不同時(shí)期的Club細(xì)胞在各級(jí)氣道中的分布、表達(dá)、增殖能力和分泌功能變化進(jìn)行闡述。研究出生后不同時(shí)期Club細(xì)胞的發(fā)育特征對(duì)深入闡述氣道上皮的損傷修復(fù)機(jī)制具有重要意義。本研究分析了BALB/c小鼠模型不同發(fā)育時(shí)期氣道Club細(xì)胞的分布、表達(dá)、增殖和分泌等功能變化，以期為研究發(fā)育期Club細(xì)胞結(jié)構(gòu)和(或)功能異常相關(guān)疾病提供更多的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器 清潔級(jí)BALB/c孕鼠12只(購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，單獨(dú)飼養(yǎng)于獨(dú)立通氣的消毒飼養(yǎng)盒內(nèi)，并提供恒定25 ℃室溫、50%～65%濕度、12 h/d光照的環(huán)境條件。多聚甲醛購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、膠原蛋白酶Ⅰ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗CC16小鼠來(lái)源的單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；抗小鼠熒光二抗AF488、CD31-Biotin、CD34-Biotin、CD45-Biotin、Scal-1-APC、CD24-PE、streptavidin-APC-Cy7、Ki-67-PE-Cy7抗體和細(xì)胞固定劑、細(xì)胞通透液購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；EpCAM-FITC抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；DAPI購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；胎牛血清、Hank's平衡鹽溶液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；小鼠CC16 ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Nikon C2 Plus激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司；流式細(xì)胞儀(FACSClibur)購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 標(biāo)本采集 孕鼠共生產(chǎn)54只新生小鼠，將小鼠分為出生后1周齡(新生期)、3周齡(幼年期)、6周齡(成年期)[12]，每個(gè)時(shí)期各18只。所有實(shí)驗(yàn)操作均在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家及單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定。將各組小鼠麻醉后心臟采血，用10 ml無(wú)菌PBS液進(jìn)行心臟灌注至雙肺發(fā)白。將右肺取出，每100 mg肺組織加入1 ml無(wú)菌PBS液，使用電動(dòng)勻漿器勻漿。根據(jù)ELISA試劑盒要求，將外周血于4 ℃下1000×g離心20 min，肺勻漿于4 ℃下5000×g離心10 min后，均收集上清儲(chǔ)存于–80 ℃。將左肺完整取出，用4%多聚甲醛溶液浸透固定，用于肺組織熒光染色。

1.3 免疫熒光檢測(cè)各級(jí)氣道Club細(xì)胞分布形態(tài)及表達(dá)豐度 氣道Club細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記方法參考本課題組前期的研究基礎(chǔ)[13]。將各組小鼠左肺于4%多聚甲醛中固定48 h，梯度乙醇脫水后石蠟包埋，連續(xù)切片(厚4 μm)，每組隨機(jī)選取12只小鼠，每個(gè)肺組織選取3張連續(xù)切片。5%BSA封閉60 min，分別用抗CC16小鼠來(lái)源的單克隆抗體(1:100) 4 ℃孵育12 h，抗小鼠熒光二抗AF488(1:500)室溫避光孵育50 min，DAPI室溫避光孵育10 min，封片后在Nikon C2 Plus激光共聚焦顯微鏡下拍攝圖像。選取氣管分出的一級(jí)支氣管為主支氣管，并在相同位置采集圖像；細(xì)支氣管圖像選取標(biāo)準(zhǔn)參考Watson等[14]對(duì)細(xì)支氣管測(cè)量的研究數(shù)據(jù)。分別于200倍鏡下采集5個(gè)主支氣管橫切面圖像，400倍鏡下采集6個(gè)細(xì)支氣管橫切面圖像，600倍鏡下采集主支氣管及細(xì)支氣管縱切面圖像。使用NIS Element Viewer 5.20軟件計(jì)算CC16相對(duì)于DAPI的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)作為反映氣道Club細(xì)胞表達(dá)豐度的指標(biāo)并進(jìn)行組間比較[13]。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)氣道上皮中Club細(xì)胞百分比及增殖能力 參照本課題組前期的研究方法[15]，麻醉處死小鼠后取出肺組織，剪碎后于37 ℃條件下以0.1%膠原蛋白酶Ⅰ孵育15 min，然后置于不銹鋼篩網(wǎng)(300目)上剪碎，將培養(yǎng)皿中獲取的肺組織單細(xì)胞懸液于4 ℃下700×g離心5 min，去上清，加入1 ml紅細(xì)胞裂解液重懸并靜置2 min，PBS洗2次，4 ℃下700×g離心5 min，去上清，使用含2%胎牛血清的Hank's平衡鹽溶液制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞表面染色：參照Li等[16]的方法，加入一抗CD31-Biotin(1:40)，CD34-Biotin(1:20)，CD45-Biotin(1:67)，EpCAM-FITC(1:100)，Scal-1-APC(1:100)和CD24-PE(1:25)于冰上孵育40 min；Hank's平衡鹽溶液終止反應(yīng)，加入二抗streptavidin-APC-Cy7(1:100)冰上孵育40 min。胞內(nèi)染色：將細(xì)胞用固定劑固定30 min，4 ℃下700×g離心5 min，去上清，加入通透液常溫通透5 min，4 ℃下700×g離心5 min，去上清后加入抗體Ki-67-PECy7(1:200)冰上孵育30 min。Hank's平衡鹽溶液終止反應(yīng)，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。CD31–CD34–CD45–EpCAM+Scal-1+CD24low鑒定為Club細(xì)胞[16]；Ki-67是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原[17]，可將Ki-67+Club細(xì)胞/Club細(xì)胞的比值作為指標(biāo)比較各組Club細(xì)胞增殖能力的差異。

1.5 ELISA法檢測(cè)小鼠CC16表達(dá)水平 取儲(chǔ)存于–80 ℃的各組小鼠肺勻漿上清、血清，采用ELISA法檢測(cè)小鼠CC16的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prim 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Games-Howell檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同時(shí)期BALB/c小鼠各級(jí)氣道Club細(xì)胞分布及表達(dá)豐度比較 免疫熒光染色結(jié)果顯示，新生期、幼年期和成年期小鼠主支氣管Club細(xì)胞在氣道上皮的表達(dá)位置參差不齊(圖1A)，而細(xì)支氣管Club細(xì)胞在氣道上皮的分布形態(tài)平坦且均勻(圖1B)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨鼠齡增長(zhǎng)，新生期、幼年期和成年期主支氣管Club細(xì)胞表達(dá)豐度逐漸下降，MFI分別為0.73±0.12、0.43±0.05、0.26±0.08，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2A)；此外，隨鼠齡增長(zhǎng)，新生期、幼年期和成年期細(xì)支氣管Club細(xì)胞表達(dá)豐度逐漸增加，MFI分別為0.49±0.07、0.73±0.08、1.02±0.19，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2B)。

圖1 不同鼠齡BALB/c小鼠主支氣管(A)、細(xì)支氣管(B)Club細(xì)胞的分布(免疫熒光染色)Fig.1 Comparison of Club cells distribution in main bronchus (A), bronchioles (B) in different ages of BALB/c mice model(Immunofluorescence staining)

圖2 不同鼠齡BALB/c小鼠主支氣管(A，n=5)、細(xì)支氣管(B，n=6)Club細(xì)胞的表達(dá)豐度比較(免疫熒光染色)Fig.2 Expression abundance of Club cells in main bronchus (A, n=5), bronchioles (B, n=6) in different ages of BALB/c mice model (Immunofluorescence staining)

2.2 不同時(shí)期BALB/c小鼠氣道上皮中Club細(xì)胞百分比及增殖能力比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，新生期、幼年期和成年期Club細(xì)胞占?xì)獾郎掀ぜ?xì)胞的百分比分別為(9.49%±2.38%)、(15.45%±3.86%)、(17.23%±4.82%)，與新生期比較，幼年期和成年期氣道上皮Club細(xì)胞百分比明顯增加(P=0.028，P=0.022)，而幼年期與成年期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.765)(圖3A)；新生期、幼年期和成年期增殖性Club細(xì)胞的占比分別為(6.12%±1.89%)、(2.36%±0.98%)、(1.94%±0.75%)，幼年期和成年期Club細(xì)胞的增殖能力明顯低于新生期(P=0.007，P=0.005)，而幼年期與成年期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.690)(圖3B)。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同時(shí)期BALB/c小鼠氣道上皮中Club細(xì)胞的占比(A)和增殖能力(B)(n=6)Fig.3 Proportion (A) and proliferation (B) of Club cells in airway epithelium in different ages of BALB/c mice model (Flow cytometry, n=6)

2.3 不同時(shí)期BALB/c小鼠肺組織勻漿、血清CC16表達(dá)水平比較 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，隨鼠齡增長(zhǎng)，新生期、幼年期和成年期肺組織勻漿上清CC16表達(dá)水平分別為(64.02±12.70) ng/ml、(89.31±5.41) ng/ml、(95.74±3.31) ng/ml，與新生期比較，幼年期和成年期肺勻漿上清CC16表達(dá)水平明顯升高(P=0.008，P=0.003)，而幼年期與成年期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.085)(圖4A)；此外，隨鼠齡增長(zhǎng)，新生期、幼年期和成年期血清CC16表達(dá)水平分別為(13.91±3.36) ng/ml、(25.77±4.68) ng/ml、(28.02±3.99) ng/ml，與新生期比較，幼年期和成年期血清CC16表達(dá)水平明顯升高(P=0.002，P<0.001)，而幼年期與成年期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.657)(圖4B)。

圖4 不同時(shí)期BALB/c小鼠肺組織勻漿(A)和血清(B)CC16表達(dá)水平比較(ELISA)(n=6)Fig.4 Expressive levels of CC16 in lung homogenates (A) and serum (B) in different ages of BALB/c mice model (ELISA) (n=6)

3 討 論

氣道上皮損傷是多種肺部疾病發(fā)病的重要機(jī)制[18-20]。Club細(xì)胞是一種異質(zhì)性、多功能的氣道上皮細(xì)胞，可作為干細(xì)胞/祖細(xì)胞及時(shí)有效地參與氣道上皮的損傷修復(fù)[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，早期CC16低表達(dá)與后期肺功能下降明顯相關(guān)[10]，提示生命早期Club細(xì)胞的正常表達(dá)對(duì)維持后期氣道功能穩(wěn)定具有重要作用。目前對(duì)出生后不同時(shí)期Club細(xì)胞的生物學(xué)特征變化知之甚少，因此，本研究對(duì)生后不同鼠齡段的小鼠氣道Club細(xì)胞進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)出生后Club細(xì)胞表達(dá)豐度不斷增加的主要部位是小氣道，而新生期則是氣道Club細(xì)胞增殖及CC16表達(dá)增加的關(guān)鍵時(shí)期。

然而，本研究發(fā)現(xiàn)，大氣道Club細(xì)胞的發(fā)育特征與小氣道截然不同。Hogan等[21]發(fā)現(xiàn)，小鼠大氣道為假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮，而小氣道上皮由簡(jiǎn)單細(xì)胞排列構(gòu)成，提示大、小氣道Club細(xì)胞分布形態(tài)不同與相應(yīng)氣道細(xì)胞組成的差異有關(guān)。主支氣管是氣管分出的一級(jí)支氣管，本研究發(fā)現(xiàn)主支氣管Club細(xì)胞表達(dá)豐度隨鼠齡增長(zhǎng)逐漸下降，與Rawlins等[22]發(fā)現(xiàn)氣管Club細(xì)胞在上皮細(xì)胞中的占比隨鼠齡增長(zhǎng)而下降一致，提示Club細(xì)胞占比或表達(dá)豐度隨鼠齡增長(zhǎng)而下降可能是大氣道的共同特點(diǎn)。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨鼠齡增長(zhǎng)，細(xì)支氣管Club細(xì)胞表達(dá)豐度增加，與Karnati等[11]報(bào)道小氣道Club細(xì)胞表達(dá)豐度的發(fā)育變化結(jié)果一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，新生期Club細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，Club細(xì)胞在氣道上皮中的占比從新生期至幼年期明顯升高。Karnati等[11]發(fā)現(xiàn)，小鼠Club細(xì)胞平均體積在生后保持不變，但Club細(xì)胞總體積和總數(shù)量在出生后早期明顯增加，提示Club細(xì)胞在新生期處于快速發(fā)育階段。CC16作為氣道含量最豐富的分泌蛋白，主要由Club細(xì)胞分泌產(chǎn)生，對(duì)維持氣道上皮完整性具有重要作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肺部、血清CC16水平在生后早期明顯升高，可能與小鼠Club細(xì)胞的胞內(nèi)分泌顆粒數(shù)量及體積僅在新生期明顯增多有關(guān)[11]，提示新生期是CC16水平增長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期。

人類肺的發(fā)育過(guò)程與小鼠相似，均需經(jīng)歷氣道的分支和延伸生長(zhǎng)[23]，其中包括各類氣道上皮細(xì)胞的發(fā)育與成熟。小氣道Club細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能損傷與哮喘、COPD等多種肺部疾病的發(fā)生密切相關(guān)[19,24-25]。了解小鼠大、小氣道Club細(xì)胞的不同發(fā)育特征，不僅可為人體Club細(xì)胞的氣道分布規(guī)律提供解釋，也可為Club細(xì)胞功能失調(diào)相關(guān)疾病的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。有研究發(fā)現(xiàn)，兒童早期呼吸道感染或環(huán)境暴露可能導(dǎo)致成年后的慢性肺部疾病[26]。流行病學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，新生期感染肺炎鏈球菌、呼吸道合胞病毒或過(guò)敏原暴露可促進(jìn)后期氣道高反應(yīng)性和(或)哮喘的發(fā)生[27-28]，其機(jī)制與氣道上皮損傷密不可分[29-30]，但這些不利因素是否導(dǎo)致Club細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能損傷，從而參與疾病的發(fā)生發(fā)展尚需進(jìn)一步研究明確。

綜上所述，本研究對(duì)不同鼠齡段小鼠氣道Club細(xì)胞的表達(dá)、增殖及分泌功能進(jìn)行分析，補(bǔ)充了肺發(fā)育過(guò)程中Club細(xì)胞的生物學(xué)特征變化。但本研究仍存在一些局限性：僅分析了小鼠主、細(xì)支氣管兩個(gè)典型支氣管解剖部位的Club細(xì)胞，未分析支氣管樹其他部位的Club細(xì)胞分布及表達(dá)特征，也未研究Club細(xì)胞的其他生物學(xué)特性如干細(xì)胞/祖細(xì)胞功能等。因此，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步加深對(duì)氣道Club細(xì)胞多種生物學(xué)特征的研究，有望為發(fā)育期Club細(xì)胞結(jié)構(gòu)和(或)功能異常相關(guān)疾病提供新的病因機(jī)制和治療方向。