容萬韜, 宋 哲, 辛 磊, 鄧維安, 覃玉月, 李曉東,*

(1.河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院, 廣西河池 547000; 2.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣西桂林 541000)

眼優(yōu)角蚱Eucriotettixoculatus(Bolivar, 1898)隸屬于直翅目(Orthoptera)蚱總科(Tetrigoidea)，廣泛分布于中國南部各省及南亞地區(qū)(鄭哲民, 2005; 鄧維安等, 2007)，主要生活在溪流旁邊生長有苔蘚的濕潤巖石周圍，以苔蘚及腐殖質(zhì)為食物(肖舒晴等, 2019)。環(huán)境中的重金屬主要通過眼優(yōu)角蚱的取食行為進(jìn)入體內(nèi)，并對(duì)其腸道微生物產(chǎn)生影響(Lietal., 2021)，據(jù)此推測(cè)，重金屬對(duì)眼優(yōu)角蚱的代謝會(huì)有一定的影響。本研究選擇金屬礦區(qū)附近環(huán)境中生存的眼優(yōu)角蚱為試驗(yàn)組，并以非金屬礦區(qū)環(huán)境中的眼優(yōu)角蚱為對(duì)照組，對(duì)其代謝組進(jìn)行研究分析，以探明暴露于重金屬復(fù)合污染下的眼優(yōu)角蚱代謝組的變化情況，進(jìn)而了解重金屬復(fù)合污染對(duì)眼優(yōu)角蚱代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 研究樣地的選擇和樣品的準(zhǔn)備

重金屬復(fù)合污染樣地選擇在廣西南丹縣刁江流域一金屬礦區(qū)(metal mining area, MA)附近，該礦區(qū)附近被鎘(Cd)、銻(Sb)、砷(As)、鋅(Zn)、鉛(Pb)和銅(Cu)等多種重金屬高度污染(鐘雪梅等, 2016)；另一樣地選擇在廣西融安縣境內(nèi)的一非金屬礦區(qū)(non-metal mining area, NMA)。2020年8月分別在兩個(gè)樣地采集眼優(yōu)角蚱成蟲雌雄各45頭，活體帶回實(shí)驗(yàn)室。每個(gè)樣地各取15頭雄蟲和15頭雌蟲組成一個(gè)樣品，共2個(gè)樣品(編號(hào)分別為：MA和NMA)，用來測(cè)定兩個(gè)樣地的眼優(yōu)角蚱體內(nèi)的重金屬含量，以明確是否受到重金屬復(fù)合污染影響。剩余的用于測(cè)定代謝組，每個(gè)樣地取10頭雄蟲和10頭雌蟲，對(duì)其進(jìn)行解剖，將腸道組織取出，用無菌雙蒸水清洗干凈，以此組成一個(gè)樣品，金屬礦區(qū)組和非金屬礦區(qū)組均準(zhǔn)備3個(gè)樣品，即3個(gè)生物學(xué)重復(fù)(編號(hào)分別為：MA1, MA2和MA3以及NMA1, NMA2和NMA3)。樣品置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 昆蟲體內(nèi)重金屬含量的測(cè)定

采用微波消解和ICP-MS法對(duì)昆蟲體內(nèi)砷(As)、鎘(Cd)、汞(Hg)、鉛(Pb)、鋅(Zn)、銅(Cu)、錫(Sn)、銻(Sb)和鉻(Cr)共9種重金屬含量進(jìn)行測(cè)定，具體步驟為：(1)眼優(yōu)角蚱成蟲全蟲烘干研磨：將準(zhǔn)備好的樣品烘干后放置研缽中充分研磨至盡可能細(xì)的粉末，干燥室溫保存。(2)消解：稱取0.2 g左右樣品進(jìn)行微波消解。(3)趕酸：消解完畢，放入通風(fēng)櫥中趕酸儀上趕酸40 min。(4)檢測(cè)：待趕酸儀溫度降至室溫，取出樣品，用超純水定容至50 mL，混勻放置澄清后，再采用ICP-MS檢測(cè)。同時(shí)稱取國家標(biāo)準(zhǔn)品作分析空白，同標(biāo)準(zhǔn)參考。

1.3 樣品代謝組分的提取

從-80℃冰箱中取出樣品于冰上解凍(后續(xù)操作都在冰上進(jìn)行)，用手術(shù)刀片切碎攪勻，用鑷子夾取一部分到去皮后的EP管中，稱量20 mg，放入一粒鋼珠，在30 Hz的條件下勻漿30 s，反復(fù)4次，加入-20℃預(yù)冷的內(nèi)標(biāo)提取液，2 500 r/min振蕩5 min，將樣品在4℃ 12 000 r/min下離心10 min，吸取上清液400 μL到對(duì)應(yīng)的EP管中，-20℃冰箱靜置30 min，4℃ 12 000 r/min下再離心3 min，取上清200 μL裝到對(duì)應(yīng)進(jìn)樣瓶內(nèi)襯管中，上機(jī)分析。

1.4 樣品的代謝組分析條件

數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography, UPLC)(ExionLC AD, https:∥sciex.com.cn/)和串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry, MS/MS)(QTRAP?, https:∥sciex.com/)。

液相條件主要包括：(1)色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm, 2.1 mm×100 mm；(2)流動(dòng)相：A相為超純水(0.1%的甲酸)，B相為乙腈(0.1%的甲酸)；(3)洗脫梯度：起始體積比為水/乙腈95∶5(v/v)，10.0 min內(nèi)線性降低至水/乙腈10∶590(v/v)，并維持1 min，在11.0-11.1 min之間把體積比恢復(fù)為水/乙腈95∶55(v/v)并維持至14.0 min；(4)流速0.4 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件主要包括：電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)溫度500℃，質(zhì)譜電壓5 500 V(正)，-4 500 V(負(fù))，離子源氣體Ⅰ(GS Ⅰ)55 psi，氣體Ⅱ(GS Ⅱ)60 psi，氣簾氣(curtain gas, CUR)25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離(collision-activated dissociation, CAD)參數(shù)設(shè)置為高。在三重四極桿(Qtrap)中，每個(gè)離子對(duì)是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(declustering potential, DP)和碰撞能(collision energy, CE)進(jìn)行掃描檢測(cè)(Chenetal., 2013)，利用軟件Analyst1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.5 代謝組數(shù)據(jù)的處理與分析

基于嘉興邁維代謝生物科技有限公司自建靶向標(biāo)品數(shù)據(jù)庫MWDB(metware database)，根據(jù)檢測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間(retention time, RT)、子母離子對(duì)信息及二級(jí)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析，利用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring, MRM)完成代謝物定量。由樣本提取物混合制備成質(zhì)控樣本，對(duì)該樣本進(jìn)行重復(fù)上機(jī)得到mix01-03，以重復(fù)測(cè)試來監(jiān)測(cè)分析樣本在相同的處理方法下的重現(xiàn)性，用變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)表示。CV值越低表示越穩(wěn)定，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)是75%的物質(zhì)CV值小于0.3。同時(shí)，在樣本中加入內(nèi)標(biāo)參與整個(gè)提取和檢測(cè)環(huán)節(jié)，通過計(jì)算內(nèi)標(biāo)的CV值表征整個(gè)項(xiàng)目提取檢測(cè)環(huán)節(jié)的穩(wěn)定性。利用R軟件(www.r-project.org/)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA)。基于正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)結(jié)果，從獲得的多變量分析OPLS-DA模型的變量重要性投影(variable importance in projection, VIP)，初步篩選出不同樣品間差異代謝物，結(jié)合單變量分析的P值或者差異倍數(shù)值(fold change)來進(jìn)一步篩選出顯著差異代謝物，篩選標(biāo)準(zhǔn)為fold change≥2和fold change≤0.5的代謝物，即代謝物在金屬礦區(qū)組組和非金屬礦區(qū)組組中差異為2倍以上或0.5以下為差異顯著；同時(shí)在差異倍數(shù)值基礎(chǔ)上VIP≥1的代謝物也為差異顯著。通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫對(duì)代謝物進(jìn)行功能注釋以及代謝通路(pathway)富集分析。

2 結(jié)果

2.1 眼優(yōu)角蚱成蟲體內(nèi)重金屬含量

經(jīng)過ICP-MS法測(cè)定兩個(gè)樣地眼優(yōu)角蚱成蟲體內(nèi)重金屬含量，由表1可知，金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱(MA)體內(nèi)重金屬含量相比非金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱(NMA)體內(nèi)重金屬含量，砷(As)是212.4倍，鎘(Cd)9.3倍，汞(Hg)1倍，鉛(Pb)18倍，鋅(Zn)0.4倍，銅(Cu)1.4倍，錫(Sn)6.7倍，銻(Sb)61.0倍，鉻(Cr)4.1倍，即除了汞(Hg)和鋅(Zn)外，其余重金屬含量均顯示金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱體內(nèi)含量明顯高于非金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱體內(nèi)的含量，說明在金屬礦區(qū)生存的眼優(yōu)角蚱體內(nèi)重金屬出現(xiàn)了累積。

表1 金屬礦區(qū)和非金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱成蟲體內(nèi)重金屬含量Table 1 Contents of heavy metals in Eucriotettix oculatus adults in the metal mining area and the non-metal mining area

2.2 樣本質(zhì)控

質(zhì)控樣本(QC)由兩組樣品混合制備而成，用于監(jiān)測(cè)分析樣品在相同的處理方法下代謝物提取和檢測(cè)的重復(fù)性，進(jìn)而反映檢測(cè)儀器的穩(wěn)定性以及試驗(yàn)的可靠性。經(jīng)樣本質(zhì)控分析， 正(A)負(fù)(B)離子檢測(cè)模式下QC樣本質(zhì)譜檢測(cè)總離子流圖(total ion current, TIC) 重疊圖顯示代謝物檢測(cè)總離子流的曲線重疊性高，即保留時(shí)間和峰強(qiáng)度均一致，表明質(zhì)譜對(duì)同一樣品不同時(shí)間檢測(cè)時(shí)，信號(hào)穩(wěn)定性好，試驗(yàn)結(jié)果可靠，可進(jìn)行下一步的研究分析。

2.3 主成分分析

為考察金屬礦區(qū)組和非金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱體內(nèi)代謝物是否存在差異，我們對(duì)分組樣品進(jìn)行主成分分析。6個(gè)樣品的PCA分析，經(jīng)過降維處理后橫坐標(biāo)(PC1)對(duì)組間樣本差異貢獻(xiàn)率為33.81%，縱坐標(biāo)(PC2)對(duì)組間差異貢獻(xiàn)率為24.5%(圖1)。樣品間距離越近則說明其體內(nèi)代謝物越接近。組間樣品的PCA分析顯示，兩組樣品能夠較好地分開。以上結(jié)果說明，金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱體內(nèi)代謝物與非金屬礦區(qū)組相比存在差異。

圖1 金屬礦區(qū)組和非金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱成蟲體內(nèi)代謝物主成分分析得分圖Fig.1 Score of principal component analysis (PCA) ofmetabolites in Eucriotettix oculatus adults in the metalmining area group and the non-metal miningarea group百分比表示主成分對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)值；圖中的每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)樣品，同一個(gè)組的樣品使用同一種顏色表示；MA1-MA3表示金屬礦區(qū)采集的3個(gè)樣品；NMA1-NMA3表示非金屬礦區(qū)采集的3個(gè)樣品。The percentage represents the contribution value of the principal component to the sample difference.Each point in the figure represents a sample， and the samples of the same group are represented by the same color.MA1-MA3 represent three samples collected from the metal mining area, and NMA1-NMA3 represent three samples collected from non-metal mining area.

2.4 重金屬復(fù)合污染下眼優(yōu)角蚱體內(nèi)代謝物分類

基于UPLC-MS/MS檢測(cè)平臺(tái)，MA和NMA兩組樣品共檢測(cè)到625種代謝物，占比較高的為氨基酸及其代謝物、脂肪酰類、有機(jī)酸及其衍生物、核苷酸及其代謝物、甘油磷脂類，分別為21.76%, 13.76%, 13.12%, 12.32%和10.24%。金屬礦區(qū)組檢測(cè)到622種代謝物，非金屬礦區(qū)組檢測(cè)到621種代謝物，有3種代謝物只存在于非金屬礦區(qū)組的眼優(yōu)角蚱體內(nèi)，分別是?；悄懰?、花生油酸、N-乙酰-L-谷氨酰胺，有4種代謝物只存在于金屬礦區(qū)組的眼優(yōu)角蚱體內(nèi)，分別是維生素D3、馬尿酸、血栓素B2、黃素單核苷酸(FMN)；金屬礦區(qū)組和非金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱體內(nèi)的代謝物在組成類別上相似(圖2)。

圖2 金屬礦區(qū)組和非金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱成蟲腸道中代謝物的分類Fig.2 Classification of metabolites in the intestine of Eucriotettix oculatus adults inthe metal mining area group and the non-metal mining area group

2.5 差異代謝物篩選

基于OPLS-DA，結(jié)合單變量分析的P值以及差異倍數(shù)值(fold change)對(duì)差異代謝物進(jìn)行篩選。所有625種代謝物中，在同時(shí)滿足fold change≥2或fold change≤0.5和VIP≥1的條件下，金屬礦區(qū)組相比非金屬礦區(qū)組共篩選到差異顯著代謝物112種，其中上調(diào)59種，下調(diào)53種(表2和圖3)。 在112種顯著差異代謝物中，氨基酸及其代謝物(19.64%)、脂肪酰類(17.86%)、有機(jī)酸及其衍生物(12.50%)、核苷酸及其代謝物(9.82%)、苯及其衍生物(7.14%)總占比超過50%；上調(diào)的前10種顯著差異代謝物分別為黃素單核苷酸(FMN)、馬尿酸、維生素D3、血栓素B2、亞精胺、肉堿C12∶3、5-羥甲基尿嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、松柏醇和肉堿C10∶0異構(gòu)體1；下調(diào)的前10種顯著差異代謝物分別為N-乙酰-L-谷氨酰胺、?；悄懰帷⒒ㄉ退?、原膽酸、7-酮基石膽酸、12-酮基石膽酸、吲哚丙烯酸、甲酰胺、S-腺苷蛋氨酸、L-多巴和5-脫氧-5-甲硫腺苷。說明金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱成蟲體內(nèi)代謝物含量與非金屬礦區(qū)組間存在顯著差異，顯著差異代謝物主要集中在氨基酸類、脂肪酰類物質(zhì)。

圖3 金屬礦區(qū)組比非金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱成蟲腸道中顯著差異代謝物火山圖Fig.3 Volcano plot of significantly differential metabolitesin the intestine of Eucriotettix oculatus adults in the metalmining area group vs the non-metal mining area group圖中的每一個(gè)點(diǎn)表示一種代謝物，Log2FC值絕對(duì)值大于1且VIP值大于1時(shí)，認(rèn)為差異顯著。紅點(diǎn)代表上調(diào)的代謝物，綠點(diǎn)代表下調(diào)的代謝物，灰點(diǎn)代表檢測(cè)到但差異不顯著的代謝物。Each point in the figure represents a metabolite.When the absolute value of Log2FC is greater than 1 and the VIP value is greater than 1, the difference is considered significant.Red dots represent upregulated metabolites, green dots represent downregulated metabolites, and gray dots represent detected metabolites with insignificant difference.

2.6 差異代謝物KEGG功能注釋及富集分析

為探明112種顯著差異代謝物與眼優(yōu)角蚱機(jī)體功能的關(guān)系，利用 KEGG 數(shù)據(jù)庫(Kanehisa and Goto, 2000)對(duì)顯著差異代謝物進(jìn)行功能注釋和富集，共富集到132條通路(圖4)，其中注釋到生物體系統(tǒng)相關(guān)通路53條，新陳代謝相關(guān)通路45條，人類疾病相關(guān)通路共19條，遺傳信息處理相關(guān)通路1條，環(huán)境信息處理相關(guān)通路11條，細(xì)胞過程通路3條。在注釋到的132條通路中，共涉及49種差異代謝物，尚有63種差異代謝物未被注釋到通路中。對(duì)富集程度排在前20的代謝通路的分析發(fā)現(xiàn)(圖5)，富集最顯著(P<0.05)的通路共4條，分別為甲狀腺激素的合成通路、苯丙氨酸代謝通路、膽汁分泌通路、酪氨酸代謝通路，均與有機(jī)體系統(tǒng)和新陳代謝相關(guān)。經(jīng)過KEGG功能注釋及富集分析，112種顯著差異代謝物中共有49種被注釋到132條通路中，這些通路大多數(shù)與生物體系統(tǒng)和新陳代謝相關(guān)。

3 討論

本研究對(duì)生活在金屬礦區(qū)和非金屬礦區(qū)的眼優(yōu)角蚱的體內(nèi)的重金屬含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱體內(nèi)重金屬砷、銻、鉛、鎘、錫、鉻、銅的含量分別是非金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱體內(nèi)含量的212.4, 61, 18.0, 9.3, 6.7, 4.0和1.4倍，說明環(huán)境中的重金屬可以累積到眼優(yōu)角蚱體內(nèi)。通過代謝組學(xué)研究，首次發(fā)現(xiàn)了眼優(yōu)角蚱體內(nèi)共有625種代謝物。對(duì)比金屬礦區(qū)和非金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱代謝物差異，發(fā)現(xiàn)112種代謝物因?yàn)橹亟饘購?fù)合污染而產(chǎn)生了顯著變化，其中超過50%(59種)代謝物上調(diào)(表2)，這說明重金屬復(fù)合污染會(huì)導(dǎo)致眼優(yōu)角蚱體內(nèi)的代謝發(fā)生變化。類似現(xiàn)象在蜜蜂的研究上也有發(fā)現(xiàn)，Rothman等(2019)用鎘和硒酸鹽處理蜜蜂后，通過非靶向代謝組學(xué)方法獲得391種代謝物圖譜，并鑒定出58種代謝物，其中在鎘處理下2種代謝物(類香豆酸和四糖)存在顯著差異，在硒酸鹽處理下7種代謝物存在顯著差異。說明重金屬污染對(duì)昆蟲代謝具有一定的影響。

本研究中，在顯著差異的代謝物中，黃素單核苷酸(FMN)、馬尿酸、維生素D3、血栓素B2、亞精胺、肉堿C12∶3、5-羥甲基尿嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、松柏醇、肉堿C10顯著上調(diào)(表2)。周良斌(2016)研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)光激發(fā)黃素單核苷酸產(chǎn)生的自由基可以抑制肝癌細(xì)胞生長。維生素D3參與機(jī)體鈣磷代謝與骨質(zhì)鈣化，是調(diào)節(jié)骨代謝的重要內(nèi)分泌激素之一，是一種新型的免疫調(diào)節(jié)劑，具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、抑制細(xì)

胞增生、拮抗膠元形成以及調(diào)節(jié)原癌基因表達(dá)、抑制腫瘤生長等功能(毛萌和劉震, 1991; 徐璐等, 2014; 趙宇和張曉良, 2015)。敖英等(2018)研究發(fā)現(xiàn)利用亞精胺處理細(xì)胞，能夠增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)DNA損傷的應(yīng)答反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)衰老的小鼠中內(nèi)源性亞精胺含量降低，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)DNA損傷應(yīng)答能力減弱，從而加快機(jī)體衰老進(jìn)程。重金屬通過昆蟲的攝食活動(dòng)進(jìn)入腸道后，會(huì)導(dǎo)致腸細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，DNA斷裂，細(xì)胞凋亡等(Osmanetal., 2015; 柳琳, 2017; Kheirallahetal., 2019)。據(jù)此推測(cè)，本研究中以上代謝物顯著上調(diào)，可能與眼優(yōu)角蚱抵御重金屬對(duì)腸道細(xì)胞的損傷，維持細(xì)胞正常功能有關(guān)。在顯著差異的代謝物中，前10種顯著下調(diào)的代謝物有N-乙酰-L-谷氨酰胺、?；悄懰?、花生油酸、原膽酸、7-酮基石膽酸、12-酮基石膽酸、吲哚丙烯酸、甲酰胺、S-腺苷蛋氨酸、L-多巴和5-脫氧-5-甲硫腺苷(表2)，這些物質(zhì)分屬于膽汁酸類(?；悄懰?、原膽酸、7-酮基石膽酸、12-酮基石膽酸)、氨基酸衍生物(N-乙酰-L-谷氨酰胺、S-腺苷蛋氨酸、L-多巴)等。膽汁酸是膽固醇的代謝物，在機(jī)體膽固醇與能量代謝平衡和小腸營養(yǎng)物質(zhì)吸收等方面起著重要作用(劉笑和王琰, 2019)，同時(shí)可以作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)體內(nèi)膽汁酸的代謝平衡、糖脂代謝與能量代謝平衡(李灝等, 2007; 劉笑和王琰, 2019)，也有研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸有利于腸干細(xì)胞的激活，可以促進(jìn)腸道再生(Sorrentinoetal., 2020)。在重金屬復(fù)合污染環(huán)境中，眼優(yōu)角蚱腸道內(nèi)的膽汁酸類物質(zhì)顯著下調(diào)，由此推測(cè)，膽汁酸在對(duì)機(jī)體的能量調(diào)節(jié)中出現(xiàn)了消耗，也可能直接參與了代謝，以加強(qiáng)小腸營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，為機(jī)體提供更多的能量、激活腸干細(xì)胞分化成相關(guān)抗性細(xì)胞以為對(duì)抗重金屬帶來的損傷做準(zhǔn)備有關(guān)，也可能是重金屬導(dǎo)致體內(nèi)合成膽汁酸的功能受阻，導(dǎo)致體內(nèi)膽汁酸供應(yīng)不足。因此，這些物質(zhì)的顯著下調(diào)可能與眼優(yōu)角蚱機(jī)體的消化功能、蛋白質(zhì)合成與分解、脂質(zhì)代謝、增強(qiáng)機(jī)體對(duì)重金屬的耐受性有關(guān)。

112種顯著差異代謝物經(jīng)過KEGG注釋和功能富集，共有49種被注釋到132條通路中，有40種被注釋到代謝的通路中(圖4)。富集顯著的通路共有4條：甲狀腺激素合成通路、催產(chǎn)素信號(hào)通路、膽汁分泌通路、酪氨酸代謝通路(圖5)，這些通路共涉及14種差異顯著代謝物。其中共有4種差異顯著代謝物被注釋到甲狀腺激素合成通路。甲狀腺激素是促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞生長、組織分化、發(fā)育和成熟的重要因素(徐建波等, 2014)，在一定劑量范圍內(nèi)能夠加速蛋白質(zhì)的合成和糖、脂的利用，從而提高機(jī)體代謝率(張堅(jiān)等, 1992)。由此推測(cè)，甲狀腺激素合成通路的富集，可能預(yù)示著眼優(yōu)角蚱在重金屬污染環(huán)境中，需要消耗更多的能量以提高對(duì)重金屬的解毒和排泄作用(付偉利等, 2015)，從而更有利于機(jī)體對(duì)重金屬損傷的修復(fù)。

圖4 金屬礦區(qū)組比非金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱成蟲腸道中顯著差異代謝物KEGG通路注釋Fig.4 KEGG pathway annotation of significantly differential metabolites in the intestine of Eucriotettix oculatus adultsin the metal mining area group vs the non-metal mining area group

圖5 金屬礦區(qū)組比非金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱成蟲腸道中顯著差異代謝物的KEGG富集圖Fig.5 KEGG enrichment of significantly differential metabolites in the intestine of Eucriotettix oculatus adultsin the metal mining area group vs the non-metal mining area group富集因子為差異表達(dá)的代謝物中在對(duì)應(yīng)通路中的個(gè)數(shù)與該通路檢測(cè)注釋到的代謝物總數(shù)的比值，該值越大表示富集程度越大。P值為超幾何檢驗(yàn)P值，越接近于0，表示富集越顯著。圖中點(diǎn)的大小代表富集到相應(yīng)通路上的差異顯著代謝物個(gè)數(shù)。Rich factor is the ratio of the number of differentially expressed metabolites in the corresponding pathway to the total number of metabolites detected and annotated by the pathway.The higher the value is, the greater the enrichment degree is.P-value is the P-value of hypergeometric test.The closer to 0, the more significant the enrichment.The size of the dots in the graph represents the number of metabolites enriched in the corresponding pathways.

催產(chǎn)素可以借助抑制食物的攝入和胃排空，實(shí)現(xiàn)體重的控制、抗炎與氧化反應(yīng)的應(yīng)激改變，在精神疾病以及心血管病等多方面均具備明顯作用，屬于多重生物學(xué)作用特征的多肽激素(白紅文和孫洪濤, 2020)，也有研究發(fā)現(xiàn)，中樞系統(tǒng)的催產(chǎn)素是一種食欲相關(guān)的神經(jīng)元，參與小鼠采食過程中的調(diào)控過程(潘登等, 2016)。本研究中，催產(chǎn)素通路被顯著富集到，推測(cè)重金屬脅迫可能會(huì)促使眼優(yōu)角蚱的食欲發(fā)生變化，而且更偏向于增加食欲，通過攝取更多的食物來獲取更多的能量， 使機(jī)體保持足夠的能量參與細(xì)胞的修復(fù)等，以應(yīng)對(duì)重金屬對(duì)機(jī)體的傷害。

膽汁的主要作用是將脂肪乳化成微滴以利于消化，還能促進(jìn)脂肪酸及脂溶性維生素的吸收。膽汁酸是膽汁的重要組成成分，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長性能、消化酶活性、抗氧化功能、免疫功能及糖脂代謝等均有一定影響(孔祎頔等, 2020)。游離型膽汁酸主要包括膽酸(cholic acid, CA)和脫氧膽酸(deoxycholic acid, DCA)等。DCA能夠刺激肝細(xì)胞分泌大量膽汁，消除膽道內(nèi)膽汁的淤積，同時(shí)，藥物、重金屬等有毒物質(zhì)隨著膽汁外排出體外(Jinetal., 2019; 孔祎頔等, 2020)。本研究中顯著差異代謝物中膽汁酸類物質(zhì)顯著下調(diào)，而與膽汁分泌相關(guān)的通路又被富集到，更說明了眼優(yōu)角蚱可能利用了大量的膽汁酸參與機(jī)體代謝，從而促進(jìn)重金屬的排出。

酪氨酸代謝是氨基酸代謝的重要組成部分，可以由苯丙氨酸羥化生成，酪氨酸可以轉(zhuǎn)化為兒茶酚胺，兒茶酚胺類物質(zhì)作為類神經(jīng)遞質(zhì)，與人類的健康和疾病聯(lián)系緊密(Portaetal., 2020a, 200b; Taddeietal., 2020)。重金屬脅迫可以對(duì)昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)造成影響(Ilijinetal., 2010)，因此該代謝物的變化可能與此有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，生活在金屬礦區(qū)的眼優(yōu)角蚱體內(nèi)有多種重金屬累積，重金屬可導(dǎo)致其腸道組織中的代謝物發(fā)生變化，這些變化的代謝物主要集中在氨基酸及其代謝物、脂肪酰類(肉堿)、有機(jī)酸及其衍生物、核苷酸及其代謝物等物質(zhì)(圖2)；顯著差異代謝物富集到的通路主要集中在甲狀腺激素的合成通路、催產(chǎn)素信號(hào)通路、膽汁分泌通路、酪氨酸代謝通路等，說明重金屬復(fù)合污染會(huì)影響眼優(yōu)角蚱的生長發(fā)育、細(xì)胞分化、能量代謝、細(xì)胞修復(fù)等。由于本研究的樣品全部來自于野外，今后可結(jié)合室內(nèi)重金屬復(fù)合污染的試驗(yàn)來進(jìn)一步探究重金屬復(fù)合污染對(duì)眼優(yōu)角蚱代謝組的影響，為揭示重金屬對(duì)昆蟲代謝影響提供基礎(chǔ)資料。