王雅麗, 趙 瑞, 王 美, 趙萌萌, 張曉晨, 李 銳

(山西農業(yè)大學植物保護學院, 山西太谷 030801)

昆蟲體內的解毒酶系對外源有毒物質有重要的防御作用(Hemingwayetal., 2004)。羧酸酯酶(carboxylesterases, CarEs)是生物體重要的解毒酶系，廣泛存在于動植物及微生物體內，能夠把包含酯鍵的內源或外源物質分解為酸和醇(Heikinheimoetal., 1999)。羧酸酯酶具有多種生物學功能，如參與外源物質的代謝，調節(jié)生長發(fā)育，降解信息素等，是一類多功能超家族酶(Ransonetal., 2002; Kontogiannatosetal., 2011)。大部分昆蟲羧酸酯酶屬于B型酯酶(張建琴, 2014)。根據羧酸酯酶的催化能力和細胞定位，將其分為14個簇(Oakeshottetal., 2005)，歸為3個功能組，分別為與消化/解毒相關功能組(A-C簇)、與信息素/激素代謝相關功能組(D-G簇)和與神經/發(fā)育相關功能組(H-N簇)(Oakeshottetal., 2010; 張建琴, 2014)。在與神經/發(fā)育相關功能組中，乙酰膽堿酯酶具有催化能力(Johnson and Moore, 2012)。研究表明，羧酸酯酶可以降解酯類氣味分子，還可以通過失活酯類信息素和寄主揮發(fā)物來調控梨小食心蟲Grapholitamolesta的交配和覓食行為(Weietal., 2021)。 在家蠅Muscadomestica抗擬除蟲菊酯類品系中，上調的羧酸酯酶基因參與對殺蟲劑的代謝(Feng and Liu, 2020)。

星豹蛛Pardosaastrigera屬蛛形綱(Arachnida)蜘蛛目(Araneae)狼蛛科(Lycosidae)，是蜘蛛類捕食性天敵的優(yōu)勢種，星豹蛛種群數量的變化影響著害蟲的發(fā)生數量(李銳等, 2014a, 2015)?；瘜W農藥廣泛應用于農業(yè)生產中，在使用高濃度殺蟲劑防治農林害蟲的同時也嚴重威脅著害蟲天敵的生存(張珠鳳, 2001)。研究表明，高濃度除草劑脅迫后星豹蛛的活動能力顯著降低(袁澤斌等, 2017)。高濃度殺蟲劑脅迫后，星豹蛛捕食量顯著降低，雌雄蛛交配時間延長且交配率下降(劉小榮, 2013)。目前已報道的對星豹蛛的研究主要集中在生命表的構建(燕晶晶等, 2021)，化學農藥對其行為(袁澤斌等, 2017)和捕食能力(李銳等, 2014b)等方面的影響，在分子研究方面關于羧酸酯酶在星豹蛛體內的作用鮮有報道?；诒菊n題組前期對星豹蛛的轉錄組測序結果，從中篩選出15個羧酸酯酶基因，主要分布在J, M和N 3個簇，還有1個基因不能很好地與其他簇聚在一起，選擇其中4個基因進行克隆和序列分析，同時利用RT-qPCR技術檢測其在不同組織的表達特性，分析這4個羧酸酯酶基因在溴氰菊酯不同時間及不同濃度脅迫后的表達模式，為進一步探討羧酸酯酶基因的表達調控和對溴氰菊酯的解毒代謝機制研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蜘蛛

于山西省太谷區(qū)山西農業(yè)大學農學院試驗基地采集星豹蛛雄性亞成蛛，待其生長發(fā)育為成蛛后作為溴氰菊酯脅迫試驗材料。本實驗室飼養(yǎng)星豹蛛幼蛛，待其發(fā)育為成蛛作為基因克隆及不同組織表達所需試驗材料。星豹蛛單頭置于含有濕棉球的指形管中(內直徑1.5 cm，高8 cm)，在人工氣候箱(溫度29±1℃，相對濕度75%±5%，光周期16L∶8D)中飼養(yǎng)。以黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和黃粉蟲Tenebriomolitor為主要食物，每2 d喂1次，定期更換指形管。

1.2 主要試劑

RNA提取所用的柱式動物組織總RNA抽提純化試劑盒和膠回收所用的SanPrep柱式 DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；基因擴增所使用的TransStart?FastPfuDNA Polymerase和基因克隆所使用的pEASY?-Blunt Zero Cloning Kit購自北京全式金生物技術有限公司；熒光定量所使用的Talent qPCR PreMix (SYBR Green)購自天根生化(北京)科技有限公司；反轉錄試劑HiScript?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；25 g/L溴氰菊酯(deltamethrin)乳油購自拜耳作物科學(中國)有限公司。

1.3 基因克隆和生物信息學分析

從本實驗室建立的星豹蛛轉錄組數據庫(未發(fā)表)中篩選羧酸酯酶基因序列，以此為模板序列設計引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。選擇星豹蛛雌成蛛3頭提取總RNA，檢測RNA純度和濃度合格后，使用反轉錄試劑盒合成cDNA作為PCR擴增模板。PCR反應體系(50 μL): cDNA 2 μL, 上下游引物 (10 μmol/L)各1 μL, 5×TransStart?FastPfuBuffer 10 μL, dNTPs(2.5 mmol/L) 4 μL,TransStart?FastPfuDNA Polymerase 1 μL, Nuclease-free Water 31 μL。PCR反應條件: 95℃ 1 min; 95℃ 20 s, x℃ 20 s, 72℃ 1 min, 40個循環(huán); 72℃ 5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，將目的條帶進行割膠回收，回收產物連接轉化，進行菌落PCR驗證，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

使用在線軟件ExPasy-ProtParam Tool預測蛋白的基本理化性質，包括每個羧酸酯酶基因的分子量和等電點等；使用在線軟件SignalP5.0預測蛋白信號肽；使用在線軟件NetNGlyc 1.0 Server預測N-糖基化位點；在NCBI保守域數據庫(Conserved Domains Database, CDD)中分析羧酸酯酶基因編碼氨基酸的保守序列；使用DNAMAN軟件完成多序列比對，使用MEGA 7.0 軟件以鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復1 000次。

1.4 羧酸酯酶基因在星豹蛛成蛛不同組織中的表達量測定

選取雌雄成蛛各6頭，冰上迅速解剖其頭胸部、腹部和足，將相同組織混在一起提取總RNA并反轉錄合成cDNA(同1.3節(jié))，每處理重復3次。以星豹蛛β-Actin(李銳等, 2015)作為內參基因，羧酸酯酶基因RT-qPCR引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 RT-qPCR反應體系(20 μL): 2×Talent qPCR PreMix 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL, cDNA 1 μL, 50×ROX Reference Dye 0.4 μL, ddH2O 7.4 μL。RT-qPCR反應程序: 95℃ 3 min; 95℃ 5 s, 60℃15 s, 40個循環(huán); 95℃ 15 s, 55℃ 30 s, 95℃ 30 s。每樣品測定3次技術重復。

1.5 溴氰菊酯脅迫后羧酸酯酶基因的表達量測定

參照李薩麗(2017)對星豹蛛成蛛的生物測定結果，選擇LC10(5.151 mg/L)，LC30(8.619 mg/L)和LC50(12.311 mg/L)濃度溴氰菊酯，參考池仕運等(2009)采用藥膜法處理星豹蛛成蛛。用丙酮將溴氰菊酯稀釋為以上3個濃度，進行濃度效應試驗，對照組使用丙酮處理，每個濃度處理13～23頭，12 h后收集存活的星豹蛛。選擇LC30濃度(8.619 mg/L)的溴氰菊酯進行農藥時間效應試驗，對照組使用丙酮處理，對照組處理約70頭，試驗組處理約100頭，分別于處理后2, 4, 8, 12, 24和48 h收集存活的星豹蛛。每個處理取樣3頭，重復3次，提取總RNA并反轉錄合成cDNA(同1.3節(jié))，進行RT-qPCR，反應體系和反應程序同1.4節(jié)。

1.6 數據分析

基因相對表達量采用2-ΔΔCt法(Pfaffl, 2001)計算。使用WPS 2019進行數據計算，使用SPSS 25.0軟件中的Duncan氏新復極差法和獨立樣本T檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果

2.1 羧酸酯酶基因克隆及序列分析

克隆獲得星豹蛛4個羧酸酯酶基因PaCarE1-4(GenBank登錄號分別為MZ643212, MZ643214, MZ643215和 MZ643216) 的全長cDNA序列，開放閱讀框(ORF)分別長1 653, 1 803, 1 827和1 818 bp，分別編碼550, 600, 608和605個氨基酸，編碼蛋白預測分子量分別為62.29, 67.77, 68.39和68.14 kD。PaCarE1-3等電點(pI)偏酸性，分別為5.37, 5.75和5.52，與其他已報道昆蟲CarEs的等電點(Mackertetal., 2008)一致，只有PaCarE4的等電點偏堿性，為8.39。對N-糖基化位點及信號肽位置進行預測，只有PaCarE4沒有信號肽。4個PaCarEs氨基酸保守基序分析結果顯示，氨基酸序列均包含羧酸酯酶的保守結構域，絲氨酸活性中心F[GR]Gx(4)[LIVM]x[LIV]-xGxS[STAG]G和二硫鍵形成位點[EDA][DG]CL[YTF][LIVT][DNS][LIV][LIVFYW]x[PQR](“[ ]”代表不同物種在該位點為其中任意一個氨基酸)；對于RF位點，PaCarE4的苯丙氨酸F變?yōu)樯彼醀；對于DQ位點，PaCarE1變?yōu)镈M；PaCarE2和PaCarE4催化三聯(lián)體(S-E/D-H)基序發(fā)生氨基酸的替換，PaCarE1和PaCarE3具有保守的催化三聯(lián)體(圖1)。

圖1 推導的星豹蛛4個羧酸酯酶氨基酸序列比對Fig.1 Alignment of deduced amino acid sequences of four PaCarEs of Pardosa astrigera下劃線為羧酸酯酶保守結構域，氨基酸序列保守結構用長方形和三角形標出。Conserved domains of carboxylesterase are underlined, and the conserved structure of amino acid sequence is marked by rectangle and triangle.

系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)及氨基酸序列比對結果表明，PaCarE1與PaCarE3被劃分在與神經/發(fā)育相關功能組J簇，PaCarE1與擬環(huán)紋豹蛛Pardosapseudoannulataacetylcholinesterase type 2(GenBank登錄號: AHB20143.1)的氨基酸序列一致性為71.87%，星豹蛛PaCarE3與擬環(huán)紋豹蛛AChE1 variant 1(GenBank登錄號: ANQ45781.1)的氨基酸序列一致性為99.18%；PaCarE4被劃分在與神經/發(fā)育相關功能組N簇，與隆頭蛛StegodyphusmimosarumNeurotactin(GenBank登錄號: KFM76584.1)的氨基酸序列一致性為52.22%；PaCarE2單獨為一簇，與斑絡新婦蛛Nephilapilipesvenom carboxylesterase-6(GenBank登錄號: GFT66653.1)的氨基酸序列一致性為45.67%。

圖2 鄰接法構建的基于氨基酸序列的星豹蛛4個PaCarEs與其他昆蟲種CarEs的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復)Fig.2 Phylogenetic tree of four PaCarEs from Pardosa astrigera and CarEs from other insect species usingneighbour-joining method based on amino acid sequence (1 000 replicates)F: 非鱗翅目保幼激素酯酶Nonlepidopteran juvenile hormone esterases; J: 乙酰膽堿酯酶Acetylcholinesterases; M: 膠質接觸蛋白Gliotactins; N: 神經趨化蛋白Neurotactins (Oakeshott et al., 2010; 張建琴, 2014).

2.2 羧酸酯酶基因在星豹蛛成蛛不同組織的表達模式

PaCarE1-4在星豹蛛成蛛不同組織中的表達量差異顯著(P<0.05)(圖3)。PaCarE1在腹部中表達量最高，在頭胸部及足中的表達量最低；對于同種組織中的表達量，PaCarE1在雄蛛腹部中的表達量顯著高于在雌蛛中的(P<0.05)，在其余組織中的表達量在雌雄間無顯著差異(P>0.05)。PaCarE2在腹部中表達量最高，在頭胸部及在足中的表達量較低；對于同種組織中的表達量，PaCarE2在雄蛛腹部中的表達量顯著高于在雌蛛中的(P<0.05)，在雌蛛頭胸部及足中的表達量顯著高于在雄蛛中的(P<0.05)。PaCarE3在頭胸部中表達量最高，在足中次之，在腹部中最低；對于同種組織中的表達量，PaCarE3在雌蛛頭胸部中的表達量顯著高于在雄蛛中的(P<0.05)，在其余組織中的表達量在雌雄間無顯著差異(P>0.05)。PaCarE4在頭胸部中表達量最高，在足中較低，在腹部中最低；對于同種組織中的表達量，PaCarE4在雄蛛頭胸部中的表達量顯著高于雌蛛中的(P<0.05)，在其余組織中的表達量在雌雄間無顯著差異(P>0.05)。

圖3 星豹蛛成蛛不同組織中4個羧酸酯酶基因的表達模式Fig.3 Expression profiles of four carboxylesterase genes in different tissues of Pardosa astrigera adultsA: PaCarE1; B: PaCarE2;C: PaCarE3； D: PaCarE4. 圖中數據為平均值±標準誤;柱上不同大小寫字母分別表示雌性和雄性成蛛不同組織間表達量差異顯著(P<0.05, Duncan氏新復極差法)，星號表示同一組織不同性別間表達量差異顯著(P<0.05, T檢驗)。Data in the figure are mean±SE.Different uppercase and lowercase letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different tissues of female and male adults, respectively (P<0.05, Duncan’s multiple range test), while the asterisk indicates significant difference in the gene expression level in the same tissue between different genders (P<0.05, T-test).

2.3 不同濃度溴氰菊酯對星豹蛛羧酸酯酶基因表達水平的影響

與對照組相比，LC10, LC30和LC50濃度溴氰菊酯處理星豹蛛雄成蛛12 h后，PaCarE3和PaCarE4的相對表達量無顯著差異(P>0.05)；LC10濃度溴氰菊酯脅迫12 h后，PaCarE2的相對表達量顯著升高(P<0.05)，為對照的1.26倍；LC30濃度溴氰菊酯脅迫12 h后，PaCarE1和PaCarE2的相對表達量極顯著升高(P<0.01)，分別為對照的2.76和2.07倍；LC50濃度溴氰菊酯脅迫12 h后PaCarE2的相對表達量極顯著降低(P<0.01)(圖4)。

圖4 不同濃度溴氰菊酯脅迫12 h后星豹蛛雄成蛛中羧酸酯酶基因的相對表達量Fig.4 Relative expression levels of carboxylesterase genes in male adults of Pardosa astrigeraafter exposed to different concentrations of deltamethrin for 12 hA: PaCarE1; B: PaCarE2;C: PaCarE3; D: PaCarE4. CK: 丙酮Acetone.參照李薩麗(2017)對星豹蛛成蛛的生物測定結果，選擇LC10(5.151 mg/L), LC30(8.619 mg/L)和LC50(12.311 mg/L)濃度溴氰菊酯進行測定。圖中數據為平均值±標準誤；柱上星號表示與對照比較差異顯著(*P<0.05; **P<0.01)(T檢驗)。LC10(5.151 mg/L), LC30(8.619 mg/L) and LC50(12.311 mg/L) of deltamethrin were used according to the bioassay results against P. astrigera adults in Li (2017).Data in the figure are mean±SE.Asterisk above bars indicate significant difference compared with the control (*P<0.05; **P<0.01)(T-test).

2.4 溴氰菊酯脅迫不同時間后對星豹蛛羧酸酯酶基因表達水平的影響

LC30濃度溴氰菊酯脅迫星豹蛛雄成蛛2, 4, 8, 12, 24和48 h后，PaCarE4表達量與對照組均無顯著差異(P>0.05)，PaCarE1-3的表達量短期內被誘導表達(圖5)。溴氰菊酯脅迫2和8 h時，PaCarE1被誘導表達，表達量分別是對照的1.45和1.57倍(P<0.05)；12 h時，PaCarE1和PaCarE2的表達量分別是對照的2.76和2.07倍(P<0.05)；24 h時，PaCarE1的表達被顯著抑制(P<0.05)，PaCarE3的表達被顯著誘導(P<0.05)；48 h時，PaCarE3的表達被顯著抑制(P<0.05)。

圖5 LC30濃度(8.619 mg/L)溴氰菊酯脅迫不同時間后星豹蛛雄成蛛中羧酸酯酶基因的相對表達量Fig.5 Relative expression levels of carboxylesterase genes in male adults of Pardosa astrigera after exposedto LC30 (8.619 mg/L) of deltamethrin for different timeA: PaCarE1; B: PaCarE2; C: PaCarE3; D: PaCarE4. 圖中數據為平均值±標準誤;柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05, Duncan氏新復極差法)。Data in the figure are mean±SE.Different letters above bars indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s multiple range test).

3 討論

本研究基于星豹蛛轉錄組數據庫克隆得到4個羧酸酯酶基因PaCarE1,PaCarE2,PaCarE3和PaCarE4，其氨基酸序列均包含羧酸酯酶的保守結構域，絲氨酸活性中心F[GR]Gx(4)[LIVM]x[LIV]-xGxS[STAG]G和二硫鍵形成位點[EDA][DG]CL[YTF][LIVT][DNS][LIV][LIVFYW]x[PQR](“[ ]”代表不同物種在該位點為其中任意一個氨基酸)，包含RF，N端保守的半胱氨酸(C)，組成氧化洞的氨基酸(GG)，DQ，親核臂(GxSxG)及催化三聯(lián)體(S-E/D-H)(圖1)，其作用是維持蛋白高級結構的完整性和蛋白催化活性的穩(wěn)定性(Cygleretal., 1993)，其中PaCarE2和PaCarE4基因推導的氨基酸序列中催化三聯(lián)體存在氨基酸的替換，催化三聯(lián)體的改變意味著它們可能會獲得一些新的功能(Yuetal., 2009)，這兩個基因催化活性是否改變需要進一步探究。張建琴等(2014a)研究表明，飛蝗Locustamigratoria羧酸酯酶基因LmCesF1編碼序列中催化三聯(lián)體發(fā)生氨基酸的替換，將該基因干擾后，飛蝗對西維因的敏感性顯著提高，表明其可能參與對西維因的解毒代謝。PaCarE2在不同組織的表達模式與PaCarE1的相似，PaCarE1屬于J簇乙酰膽堿酯酶，能水解昆蟲中樞神經系統(tǒng)突觸上的神經遞質乙酰膽堿(Toutant, 1989)，PaCarE2與venom carboxylesterase-6有較高的相似性，關于venom carboxylesterase-6的研究較少，該酶屬于羧酸酯酶的一類，在紅光雄蜂Bombusignitus中通過降解血液甘油三酯從而參與毒液的分解(Dengetal., 2021)。PaCarE2在星豹蛛體內的作用需要進一步的功能特性分析。PaCarE1-4都具有N-糖基化位點，N-糖基化可能與酶活性的空間結構或蛋白質結構穩(wěn)定性有關(Wheelocketal., 2005)，因此推測這4個羧酸酯酶具有穩(wěn)定的蛋白結構或催化效率。

基因在生物體中組織表達的特異性與其生物學功能相關。郭艷瓊等(2017)研究了蓮草直胸跳甲AgasicleshygrophilaAhCesB1在不同組織中的表達情況，結果表明AhCesB1基因在除去頭部及中腸的殘體中高表達。葛娉婷(2012)研究表明在飛蝗脂肪體高表達的LmCarE26基因參與對溴氰菊酯的代謝。本研究分析了羧酸酯酶基因在星豹蛛成蛛不同組織中的表達情況，結果表明4個羧酸酯酶基因在被測組織中均存在，并且在不同組織中表達量存在差異(圖3)。PaCarE1和PaCarE2在雌雄成蛛腹部中表達量最高，PaCarE3和PaCarE4在雌雄成蛛頭胸部中表達量最高；徐西霞(2019)研究表明，擬環(huán)紋豹蛛羧酸酯酶基因Ppace1在腦中高表達，Ppace2在腸道中高表達，Ppace5在神經組織(腦、觸肢和足)中高表達，與本研究中羧酸酯酶基因在多個組織中分布的結果一致。

利用昆蟲代謝酶的可誘導性，可以推測其是否參與對化學殺蟲劑的代謝過程(Poupardinetal., 2008)。研究表明朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus體內4個羧酸酯酶基因可以被甲氰菊酯誘導，對能夠被誘導的4個基因進行RNAi，發(fā)現沉默其中任何一個均能提高朱砂葉螨對甲氰菊酯的敏感性，說明這4個基因與朱砂葉螨對甲氰菊酯的代謝密切相關(Weietal., 2019)。為探討星豹蛛羧酸酯酶基因是否參與星豹蛛對溴氰菊酯的代謝過程，本研究分析了溴氰菊酯脅迫后星豹蛛羧酸酯酶基因的表達情況，結果表明: LC10, LC30和LC503個濃度的溴氰菊酯脅迫12 h后，PaCarE1和PaCarE2在LC30濃度溴氰菊酯脅迫下被顯著誘導；LC50濃度溴氰菊酯脅迫下，PaCarE2表達被抑制，PaCarE3-4的表達與對照相比并無顯著變化(圖4)，這可能由于羧酸酯酶對溴氰菊酯的降解存在著濃度效應，具體的原因需要進一步探究；LC30濃度溴氰菊酯脅迫不同時間后，PaCarE1和PaCarE2在短時間脅迫后能被誘導表達，溴氰菊酯的脅迫對PaCarE4表達量沒有影響(圖5)，這與張建琴等(2014b)研究飛蝗羧酸酯酶基因在溴氰菊酯不同濃度及不同時間處理后，不同基因對溴氰菊酯響應不同結果一致。

星豹蛛頭胸部的神經系統(tǒng)較多，并且頭胸部中分布著消化道的前腸和中腸，主要由咽、吸吮胃和盲管組成，能把液態(tài)食物吸入體內(張征田等, 2010; 龔忱和王智, 2011)；腹部分布后腸和馬氏管等組織，昆蟲腸道能分泌解毒酶對外源物質進行降解，馬氏管是排泄器官，參與對外源物質的代謝(Yangetal., 2007)，因此推測不同的羧酸酯酶在不同的組織中均可能發(fā)揮代謝作用。綜合羧酸酯酶基因在星豹蛛不同組織及溴氰菊酯脅迫后的表達情況，推測PaCarE1,PaCarE2和PaCarE3可能參與星豹蛛對溴氰菊酯的代謝?；瘜W農藥處理濃度的大小及處理時間的長短都會對基因誘導造成一定影響，所以要闡明一個基因在化學農藥代謝中的作用，我們需要利用RNA干擾技術沉默單個基因進行間接驗證或將基因體外表達同時給予代謝底物直接證明基因功能。

本研究對星豹蛛4個羧酸酯酶基因進行克隆，并測定其在星豹蛛成蛛不同組織及在溴氰菊酯脅迫后的表達情況，推測其在星豹蛛體內可能發(fā)揮的作用，為進一步羧酸酯酶基因功能驗證提供了基礎資料。