趙麗 盧弘 胡曉鳳

臨床醫(yī)學(xué)將虹膜睫狀體、脈絡(luò)膜組織炎癥疾病統(tǒng)稱為葡萄膜炎，是一種臨床較為常見的眼科疾病[1,2]。有研究表示，葡萄膜炎癥狀發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，具有臨床治療難度大、病情易反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，甚至有些患者治療過程中因出現(xiàn)其他并發(fā)癥而導(dǎo)致嚴(yán)重視力損傷甚至失明，因此越來越多的專家學(xué)者致力于葡萄膜炎臨床治療的研究[3,4]。色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)具有抑制新生血管、抗炎、神經(jīng)營養(yǎng)等多種作用，目前PEDF的抗炎作用是許多專家學(xué)者的主要研究方向[5,6]。本研究使用腺病毒載體介導(dǎo)PEDF基因轉(zhuǎn)染大鼠，探究PEDF在大鼠虹膜睫狀體中的表達(dá)，及PEDF基因表達(dá)的干預(yù)機(jī)制，為進(jìn)一步研究PEDF的作用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

資料與方法

一、材料

實(shí)驗(yàn)研究。選取60只健康Wister大鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，年齡7～11個月，平均(9.0±1.6)個月；體重219～242 g，平均體重(230.5±9.2)g。在光照12 h/d、相對濕度48%～55%、溫度(22.7±2.3)℃環(huán)境中飼養(yǎng)。本研究獲我院倫理委員會批準(zhǔn)?；魜y弧菌內(nèi)毒素LPS(18 001株，古典生物型，小川血清型，蘭州生物制品研究)；PEDF、Notch1、DLL4、VEGF抗體(英國abcam 公司)，TLR4抗體、MyD88抗體、NF—KB p65抗體(美國Santa Cruz公司)

二、建模及處理

1.AV-PEDF構(gòu)建：依據(jù)人PEDF基因信息原始質(zhì)粒GV314Z設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，由吉凱基因公司設(shè)計(jì)引物序列，使用T4DNA連接酶將回收PCR產(chǎn)物、載體進(jìn)行連接，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化、篩選獲得重組質(zhì)粒，并用過PCR、酶切及測序分析進(jìn)行測序鑒定。

使用胰消化酶對293TN細(xì)胞進(jìn)行消化后接種至培養(yǎng)皿，1.5×100/皿，添加10%FBS DMEM培養(yǎng)基，使用37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，接種至24孔板，293TN細(xì)胞生長至70%融合后轉(zhuǎn)染，取轉(zhuǎn)染復(fù)合物，6孔板(含細(xì)胞及完全培養(yǎng)基)內(nèi)混合，靜置6 h，換培養(yǎng)液后置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。轉(zhuǎn)染2d后顯微鏡觀察，顯示細(xì)胞液發(fā)黃，貼壁細(xì)胞密度達(dá)90%，細(xì)胞貼壁狀態(tài)較好(圖1)。取細(xì)胞上清液進(jìn)行離心處理，將細(xì)胞碎片沉淀去除后使用PVDF膜過濾，冰浴保存，次日取50%上清再次感染HEK293細(xì)胞，50%左右細(xì)胞漂起后再次采集病毒上清，反復(fù)于HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增病毒至所需滴度。將HEK293細(xì)胞添加至48孔板，3×104/孔，1 d后，使用DMEM培養(yǎng)基10倍梯度稀釋病毒：第一排每孔添加10 μl病毒原液，充分混合后取10 μl混合液添加至第二排，在此過程中避免產(chǎn)生氣泡，按此步驟操作直至第八排孔，感染2 d后對熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，病毒滴度為1×1011PFU/ml。

圖1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光觀察

2.建模及分組處：60只Wistar大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為3組(模型組、模型+AV-blank組、模型+AV-PEDF組),每組20只。所有大鼠參照文獻(xiàn)[3]的方法制作EIU動物模型。將霍亂弧菌內(nèi)毒素LPS溶于無菌生理鹽水中，配成質(zhì)量濃度為2 g/L的注射液。模型組每只大鼠足底注射0．1 ml霍亂弧菌內(nèi)毒素LPS注射液。同時(shí)模型+AV-blank組和模型+AV-PEDF組大鼠，經(jīng)20%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)腹腔注射麻醉，微量加樣器向右眼前房分別注射等量AV-blank和AV-PEDF10Ul(AV-PEDF109 Pfu)。7 d后大鼠心臟灌注4%多聚甲醛，頸椎脫臼法處死，取每組大鼠右眼球虹膜睫狀體組織。

3.Western blot法檢測：PEDF、VEGF、Notch1、DLL4、TLR4、MyD88、NF-κB p65相對表達(dá)量檢測，取各組大鼠虹膜睫狀體組織，添加細(xì)胞裂解液后機(jī)械勻漿、離心處理，取上清BCA法蛋白定量并調(diào)節(jié)蛋白濃度。取50 μg總蛋白用12%SDS-PAGE凝膠電泳，分離蛋白，切開凝膠轉(zhuǎn)膜2 h至PVDF膜上，室溫封閉膜6 0min后洗膜，添加一抗PEDF、VEGF、Notch1、DLL4、TLR4、MyD88、NF-κB p65，孵育(用0.02% Triton X一100按1：50稀釋)后4 ℃過夜保存，次日使用TBST清洗，加入對應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，Western洗滌液洗滌后顯色、曝光、成像。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS21.0軟件分析，蛋白免疫印跡法數(shù)據(jù)資料經(jīng)D檢驗(yàn)(P=0．174)和w檢驗(yàn)(P=0.184)呈正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較行單因素方差分析,組間均數(shù)比較采用turkey檢驗(yàn)，采用雙尾檢測法，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、各組大鼠PEDF、VEGF表達(dá)對比

如表1，圖2所示，與模型組、模型+AV-blank組比較，模型+AV-PEDF組大鼠PEDF表達(dá)較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組、模型+AV-PEDF組比較，模型+AV-blank組大鼠PEDF表達(dá)較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組、模型+AV-blank組比較，模型+AV-PEDF組大鼠VEGF表達(dá)較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組、模型+AV-PEDF組比較，模型+AV-blank組大鼠VEGF表達(dá)較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠PEDF、VEGF表達(dá)對比

圖2 PEDF、VEGF表達(dá)WB圖

表2 各組大鼠Notch1、DLL4表達(dá)對比

圖3 Notch1、DLL4表達(dá)WB圖

二、各組大鼠Notch1、DLL4表達(dá)對比

如表2、圖3所示，與模型組、模型+AV-blank組比較，模型+AV-PEDF組大鼠Notch1相對表達(dá)量較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組、模型+AV-blank組比較，模型+AV-PEDF組大鼠DLL4相對表達(dá)量較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

三、各組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB通路蛋白表達(dá)比較

如表3、圖4所示，與模型組、模型+AV-blank組比較，模型+AV-PEDF組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65相對表達(dá)量較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達(dá)比較

圖4 TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達(dá)WB圖

討 論

葡萄膜炎是一種常見的致盲性眼科疾病，對患者身體健康、生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[7，8]。據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，近年來我國葡萄膜炎發(fā)病率未出現(xiàn)下降趨勢，每年新增葡萄膜炎病例數(shù)居高不下，引起廣大專家學(xué)者的關(guān)注[9，10]。目前臨床常用的治療葡萄膜炎的手段為免疫抑制劑、抗生素、糖皮質(zhì)激素治療，但臨床療效并不理想，具有較高的復(fù)發(fā)率，甚至許多患者因此失明，因此越來越多專家學(xué)者開始致力于葡萄膜炎臨床治療的研究[11，12]。

PEDF為絲氨酸蛋白酶超家族的主要組成成員，大量實(shí)驗(yàn)研究表明，PEDF具有抗氧化、神經(jīng)營養(yǎng)、抑制新生血管、抗炎、抗腫瘤等多種作用，同時(shí)越來越多的研究表明PEDF參與了炎癥前和炎癥反應(yīng)過程。其表達(dá)變化參與炎癥反應(yīng)，在諸多眼科疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。研究表明單獨(dú)其表達(dá)的下調(diào)即可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，提示其具有高效的抗炎作用[13]。其在眼內(nèi)組織中分布廣泛，角膜、睫狀體、晶狀體、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜均可以檢測到PEDF mRNA和蛋白的表達(dá)，提示這些部位的某些細(xì)胞具有合成和分泌PEDF的能力，同時(shí)也反映出PEDF在這些中可能具有重要的功能作用[14]。

Notch信號通路對機(jī)體免疫應(yīng)答、新生血管生長、發(fā)育具有調(diào)控作用，調(diào)控Notch通路蛋白Notch1、DLL4表達(dá)能夠?qū)渫粻罴?xì)胞免疫應(yīng)答。在信號 通 路 中 Notch1 可 促 進(jìn) 血 管 新 生 及 血 管 發(fā) 展, DLL4 可抑制血管出芽過程中端細(xì)胞的形成從而抑制血管 新生。DLL4是 Notch 信號通路中重要配體,在血 管形成中呈相反表達(dá)。同 時(shí) 還 發(fā) 現(xiàn)Notch 信號通路的激活可刺激VEGF上調(diào)[15]。但是尚未發(fā)現(xiàn) Notch 信號通路在葡萄膜炎 中相關(guān) 研究。在眼部Zhang 研究發(fā)現(xiàn)PEDF可以通過稀釋視網(wǎng)膜血管中VEGF的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,給與PEDF組 Notch1蛋白表達(dá)降低,DLL4 蛋白表達(dá)升高, VEGF的表達(dá)降低，提示PEDF可能通過抑制 Notch 信號通路,下調(diào)VEGF表達(dá)參與葡萄膜炎的發(fā)病過程。

TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達(dá)與機(jī)體炎癥反應(yīng)具有密切聯(lián)系[17]。李上等[18]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素可以通過過度激活TLR4介導(dǎo)的天然免疫和獲得性免疫，從而啟動急性前葡萄膜炎，內(nèi)毒素誘導(dǎo)的EIU虹膜內(nèi),TLR4及其下游信號傳導(dǎo)分子MyD88/NF-κB的表達(dá)量發(fā)生改變,提示TLR4-MyD88依賴傳導(dǎo)途徑可能參與了EIU的發(fā)病.

本研究顯示，腺病毒載體介導(dǎo)PEDF基因轉(zhuǎn)染虹膜睫狀體的大鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65呈現(xiàn)降低，出現(xiàn)這一研究結(jié)果的原因可能是上調(diào)PEDF表達(dá)能夠靶向調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達(dá)，從而起到抗炎作用，抑制葡萄膜炎癥狀的發(fā)生發(fā)展。Notch信號通路與TLR4-MyD88依賴傳導(dǎo)途徑的變化提示PEDF可能分別通過機(jī)體免疫應(yīng)答、新生血管生長、機(jī)體炎癥反應(yīng)等多方面參與葡萄膜炎的病理過程。在今后的研究中心我們將進(jìn)一步深入研究PEDF在每一種信號通路中的調(diào)控作用。

綜上所述，腺病毒載體介導(dǎo)PEDF基因轉(zhuǎn)染的大鼠虹膜睫狀體組織中PEDF變化與Notch 信號通路,和TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達(dá)相關(guān)，這有助于人們對葡萄膜炎發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識，為葡萄膜炎的治療提供基礎(chǔ)依據(jù)。