趙玉雪

(浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江 杭州 311300)

0 引言

與原兒茶醛不同，丹參素在治療心血管類疾病的藥理作用方面，除了可以通過降低炎癥因子表達防止動脈粥樣硬化，降低Ca2+超載、清除自由基以保護心肌細胞外，還可以通過抑制心肌肥大、優(yōu)化心肌能量代謝、改善心肌血流動力、降低心肌氧攝取率、抑制心肌纖維化來發(fā)揮功效[1].更重要的是丹參素的毒副作用小，因此其具有更好的開發(fā)利用前景.其他小分子化合物,如咖啡酸等,作用機制類似，具有相似的藥理活性.而較為復(fù)雜的酚酸類成分,如迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B等，其藥理作用機制與小分子化合物類似.以丹酚酸B為例，可以通過降低超敏C反應(yīng)蛋白、同型半胱氨酸、低密度脂蛋白膽固醇表達來延緩動脈粥樣硬化的進程,通過清除自由基對心肌再灌注損傷起保護作用,同時降低炎癥因子的表達和Ca2+超載來重構(gòu)修復(fù)心肌組織,改善血管內(nèi)皮功能,改善微循環(huán)，擴展冠脈血管以改善不穩(wěn)定型心絞痛的預(yù)后[2-8].

1 儀器和試藥

1.1 儀器

安捷倫1290A Infinity Ⅱ 超高效液相色譜儀配G7120A二元高壓泵、G7167B自動進樣器、G7167-60005控溫箱、G7116B柱溫箱及G7117BDAD檢測器；6530A四極桿-飛行時間質(zhì)譜配雙噴流電噴霧離子源(Dual AJS ESI)；控制及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為MassHunter化學(xué)工作站(B.08.00).

1.2 試藥

丹參素鈉、肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸A和丹酚酸B標準品,購買自上海源葉生物有限公司;L-苯丙氨酸、原兒茶醛和原兒茶酸標準品,來源于中國藥品生物制品檢定所;紫草酸標準品,購買自大連美侖生物有限公司；質(zhì)譜級甲醇和乙腈,購于德國默克有限公司;超純水,由Milli-Q系統(tǒng)制備(美國Millipore公司).

2 試驗

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：沃特世ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相為甲酸-乙腈(體積分數(shù)為0.2%)，梯度洗脫；體積分數(shù)為5%～95%的乙腈(0～20 min)，后運行時間:3 min；流速:0.3 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫:35 ℃.

2.1.2 質(zhì)譜條件

采用雙噴流電噴霧離子源，負離子模式掃描，以高純N2作為霧化電離氣，設(shè)置干燥氣溫度350 ℃，流速11 L/min，霧化氣壓310.275 kPa，鞘氣溫度、流速設(shè)置與干燥氣相同，毛細管電壓4 kV， 碎片電壓 120 V，錐孔電壓 60 V，采集范圍為m/Z=100～3 200.儀器使用前以調(diào)諧液對儀器進行校正，使用過程中不間斷加入?yún)⒈纫哼M行質(zhì)量校準.

2.2 對照品和供試品溶液的配制

分取1 mg對照品配成終濃度為1 mg/mL的母液，等體積混合后稀釋至濃度均為2 μg/mL的溶液.供試品材料為陜西商洛GAP基地栽培的丹參株系采收的成熟種子,培植在濕度75%，溫度25 ℃的溫室中，經(jīng)過10個月培育后采收，將其根系拆分為主根和須根，分別晾干后取適量磨粉過40目篩，分取0.1 mg粉末置于10 mL容量瓶，加入甲醇至刻度線，稱重，超聲30 min，冷卻后補足失重.取100 μL提取液于35 ℃、2 000 r/min轉(zhuǎn)速下?lián)]干，10倍體積復(fù)溶，復(fù)溶液于4 ℃離心30 min后分取上清作為供試品溶液.

3 結(jié)果

3.1 對照品溶液的UHPLC-Q-TOF/MS成分分析

用UHPLC-Q-TOF/MS對丹參11種酚酸類成分進行定性分析，負離子模式下提取特征離子色譜圖,見圖1(a).主要成分的保留時間及主要碎片離子峰數(shù)據(jù)見表1.

圖1 丹參負離子模式下提取特征離子色譜

表1 丹參11種酚酸類成分的定性分析數(shù)據(jù)

3.2 丹參供試品成分鑒定

以同樣的色譜質(zhì)譜條件分別對丹參主根須根供試品溶液進行定性分析，特征離子色譜圖見圖1(b)、圖1(c).圖中12號化合物保留時間為7.368 min，負離子模式下主要獲得717.146 9的分子離子峰，推測其為丹酚酸B的同分異構(gòu)體，因丹酚酸B的同分異構(gòu)體丹酚酸E、丹酚酸L、異丹酚酸B結(jié)構(gòu)相似，MS2(二級質(zhì)譜)仍無法鑒定，需其他分析方法做進一步鑒定.

3.3 丹參主根須根中主要活性成分相對定量分析

以內(nèi)參L-phe-d5作校正后，主根須根中主要活性成分含量見表2.受樣品提取溶劑、提取方法選擇的影響,樣品提取率低，某些化合物未達到檢測下限，但以已檢測出的化合物做統(tǒng)計學(xué)分析，主根、須根中主要活性成分含量無統(tǒng)計學(xué)差異.

表2 主要活性成分含量 單位：μg/mg

4 分析與討論

在中國藥典中,對鑒定丹參酚酸類成分所用的提取溶劑為體積分數(shù)為80%的甲醇，筆者為獲取更多的化合物信息數(shù)據(jù)而選擇純甲醇用作提取溶劑.該操作導(dǎo)致供試品溶液中酚酸類成分提取率不高，影響了藥材在質(zhì)譜上的檢測，導(dǎo)致某些化合物沒有響應(yīng)，故仍需進一步優(yōu)化該檢測方法，提高檢測的靈敏度.

以已鑒定出的丹參素、丹酚酸B等主要活性成分來看,丹參主根、須根中主要酚酸類成分含量無明顯差異.尉廣飛等發(fā)現(xiàn),與主根相比，直徑相對較細的須根中脂溶性的丹參酮類成分含量相對較高.以上研究均表明,與主根相比，須根具有相似的藥用活性[9].但是實際炮制過程中一般是去須根然后主根切厚片制成丹參飲片，這種炮制方法在一定程度上是對丹參原藥材的浪費.因此，需要在飲片炮制加工過程中不去細條和須根，或者將提取的須根酚酸類成分用于總酚酸鹽注射液或丹紅注射液等臨床常用制劑的制備,以實現(xiàn)丹參藥材的合理利用并緩解丹參藥材供不應(yīng)求的情況.