周 立，張洪波，李婧婧，李澤明，李佳穎

（湖南省煙草公司永州市公司，湖南 永州 425000）

蟲生真菌的廣義定義是指與昆蟲（同時包括螨、蜘蛛、蜈蚣等節(jié)肢動物及線蟲）有各種直接關(guān)系的真菌種類。自然界中蟲生真菌資源豐富，種類繁多，據(jù)不完全統(tǒng)計，在我國已發(fā)現(xiàn)蟲生真菌40 屬400 種以上[1-2]。蟲生真菌與人類生活息息相關(guān)，主要體現(xiàn)在食用、藥用、生防等方面。例如：冬蟲夏草、蟬花等具有獨特的食用和藥用價值[3-4]；而白僵菌、綠僵菌、蠟蚧輪枝菌等在生物防治中應(yīng)用較為廣泛，可有效減少化學(xué)農(nóng)藥的使用[5]。

永州市位于湖南省南部，主要農(nóng)作物有水稻、花生、甘蔗、柑橘、烤煙，危害當?shù)剞r(nóng)作物的害蟲主要有稻飛虱、蚜蟲、斜紋夜蛾、柑橘蚧蟲等，給當?shù)剞r(nóng)作物帶來巨大的經(jīng)濟損失。目前，作物害蟲的防治主要還是依賴化學(xué)藥劑。然而，在化學(xué)防治的同時，害蟲快速產(chǎn)生的抗藥性也給人類生存環(huán)境和食品安全帶來極大危害。而利用蟲生真菌防治農(nóng)業(yè)害蟲可以一定程度地減少上述危害。隨著蟲生真菌在害蟲防治領(lǐng)域應(yīng)用研究的不斷深入，這種“新式”害蟲防治策略不斷被人們所認可。例如：許忠順等[6]研究表明，環(huán)鏈棒束孢GZUIFR04XS8 對斜紋夜蛾（Spodoptera litura）蛹和幼蟲有較好的防治潛力；周建云等[7]研究發(fā)現(xiàn)，白僵菌Bb062 菌株對煙青蟲（Helicoverpa assulta）3齡幼蟲有較高的毒力。

為了全面了解我國蟲生真菌的種質(zhì)資源，研究人員在全國各地對蟲生真菌的多樣性展開調(diào)查。王軍等[8]對秦巴山區(qū)蟲生真菌種類進行調(diào)查，共分離出9目13 科22 屬，優(yōu)勢目為叢梗孢目（Moniliales）。周家喜等[9]調(diào)查了堯人山國家森林公園的蟲生真菌資源，共培養(yǎng)出3 科7 屬10 種，其中白僵菌屬為優(yōu)勢屬。蟲生真菌的種類豐富度及數(shù)量受到昆蟲活動、地面覆蓋物及環(huán)境中人類活動程度等眾多因素的影響，且各因素之間有著相互關(guān)聯(lián)，部分真菌只在特定的自然環(huán)境下表現(xiàn)為蟲生真菌[10-11]。同時有研究表明，蟲生真菌與當?shù)氐耐寥勒婢P(guān)系密切[12-14]。為了盡可能地收集潛在的蟲生真菌，蟲害高發(fā)區(qū)的土壤真菌引起了學(xué)者們的關(guān)注。與外地引入的蟲生真菌菌種相比，當?shù)夭杉南x生真菌菌種與害蟲物種的生態(tài)兼容性（濕度、溫度、紫外吸收能力等）更好，并能降低對非目標生物的風(fēng)險[15]，因此在主要害蟲發(fā)生區(qū)收集并篩選當?shù)赝寥勒婢械南x生真菌種質(zhì)資源具有重要意義。筆者調(diào)查了永州地區(qū)的蟲生真菌資源，填補了湖南省永州市蟲生真菌資源庫的空白，也為后續(xù)篩選害蟲高致病力菌株奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 蟲生真菌土壤樣品采集2018—2019 年，在永州市范圍內(nèi)采集土樣，根據(jù)不同地區(qū)自然地理區(qū)劃、生態(tài)區(qū)劃、氣候、地表植被等因素，選擇有蟲害的田塊及周邊不同生境和土壤較肥沃的位置作為采樣點。采集土樣時去掉表層土，取土表以下深5～10 cm 處的土壤200 g 左右，放入樣品袋中，在樣品袋標簽上標明編號、地點、時間、海拔高度等信息，于4℃保存等待處理。共采集土壤標樣427 份。

1.1.2 供試蟲源斜紋夜蛾蟲卵（科云生物有限公司）采用人工飼料飼養(yǎng)于生物防治教育部工程研究中心的RXZ-500C 型智能人工氣候箱（寧波江南儀器廠）進行繼代繁殖，形成斜紋夜種群。飼養(yǎng)條件為溫度（27±1）℃，光周期 L ∶D =14 ∶10，相對濕度（75±5）%。選取斜紋夜蛾2 齡幼蟲進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤中真菌的分離與純化將土壤樣品過篩去掉石粒和雜物，取凈土10 g 懸浮于90 mL 0.1%的吐溫-80 溶液中搖勻，靜置15 min，取上清液2 mL 稀釋于8 mL 0.1%吐溫-80 中，配制成土壤懸浮液。再將土壤懸浮液稀釋10 倍。取0.5 mL 土壤懸浮液和稀釋液分別接種于孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基平板上，各重復(fù)4 次，用涂布棒涂抹均勻，25℃培養(yǎng)3～7 d，然后用接種環(huán)挑取單菌落，接種于PDA 板上繼續(xù)培養(yǎng)，如有污染繼續(xù)挑選純化，直至培養(yǎng)基中長出單一菌落。

1.2.2 菌株形態(tài)特征及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)觀察將菌株接種于PDA 平板上，在（25±0.5）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，待培養(yǎng)成熟，制作產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)標本，觀測菌落形態(tài)特征（正面和背面的顏色、質(zhì)地、大小、高度、表面、邊緣等），并拍照記錄。

1.2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定選擇Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司] 進行真菌總DNA 提取，以通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、ITS5（5′-GGAA GTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）進行菌株的ITS 區(qū)擴增，擴增條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35 個循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增產(chǎn)物情況。將陽性樣品送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序，再利用Genious 7.1.4 軟件進行序列拼接，然后在NCBI 中采用BLAST 工具進行同源相似性搜索，采用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 孢子懸浮液的配制取培養(yǎng)10～14 d 分離純化的菌株在超凈工作臺內(nèi)加入含0.1%吐溫-80 的蒸餾水刮除菌落，洗出平皿內(nèi)的孢子，轉(zhuǎn)移到滅菌的三角瓶中，使用恒溫磁力攪拌器中速攪拌20 min，使其均勻分散，配制成母液。按照10 倍稀釋法將菌液稀釋100 倍，顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)分生孢子數(shù)，5次重復(fù)。然后將分生孢子濃度稀釋至1×108CFU/mL備用。

1.2.5 菌株致病力測試將鑒定后的菌種分別培養(yǎng)制成孢濁液，采用浸蘸法用毛筆將幼蟲挑入濃度為1×108CFU/mL 的孢子懸浮液中浸泡約5 s，然后轉(zhuǎn)移至含飼料的培養(yǎng)皿中觀察。用已滅菌的0.1%吐溫-80作對照，每個處理20 頭幼蟲，3 次重復(fù)。完成接種后，所有培養(yǎng)皿（直徑為12 cm）用保鮮膜封口并刺孔通氣后置于生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，連續(xù)7 d 逐日定時觀察記錄，并及時將蟲尸移出，蟲尸置于26℃下保濕培養(yǎng)且根據(jù)斜紋夜蛾2 齡幼蟲尸體體表長出物特征確認有效致死，感病的蟲尸即為僵蟲。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

死亡率（%）=（試蟲死亡數(shù)/試蟲數(shù)）×100

校正死亡率（%）=（處理組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）×100

利用SPSS 21.0 軟件進行試驗數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析對斜紋夜蛾2 齡幼蟲死亡率進行處理，并運用Tukey 檢驗差異顯著性，用GraphPad Prism 8繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品中真菌的分離純化

使用選擇性培養(yǎng)基對永州市6 個縣采集煙田的土壤標樣進行真菌分離、純化，得到66 株菌株，其中寧遠縣、新田縣、藍山縣、江永縣、江華縣、道縣分別分離得到菌株10、17、15、4、8、12 株，編號后保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治教育部工程研究中心，為進一步菌株鑒定做準備。

2.2 菌落形態(tài)及孢子結(jié)構(gòu)分析

對分離純化的菌株進行菌落形態(tài)及孢子結(jié)構(gòu)的觀察，依照特征，這66 株菌株大致可分為白僵菌屬、蟲草屬、綠僵菌屬、青霉屬、擬青霉屬、籃狀菌屬6 類。具體特征描述如下。

圖1 中，A、B 所示菌落粉狀、絨狀或茸毛狀，表面白色、乳白色或淡黃色；G、H 所示菌絲細長透明有隔，產(chǎn)孢細胞形狀不定，瓶狀或絲狀，垂直著生在主軸菌絲上或短的分支上，形成一個球形的產(chǎn)孢細胞束，分生孢子為球形或卵形，孢子著生于產(chǎn)孢細胞頂部延伸而成的之字形絲狀結(jié)構(gòu)上，均為白僵菌屬典型的形態(tài)特征； C、D 所示菌落平展，菌絲薄，表面有細顆粒結(jié)構(gòu)，白色，菌落不規(guī)則形，邊緣呈樹狀分枝，背面中部褚石色，向外逐漸變淡；I、J 所示菌絲分隔，透明，光滑，分生孢子透明，光滑，長梭形或近柱狀，排列成長鏈狀，為蟲草屬典型形態(tài)特征；E、F 所示菌落呈灰橄欖色，整體較薄，平坦，邊緣整齊，質(zhì)地絨狀，無滲出液，無可溶性色素，菌落背面呈淡黃色；K、L 所示分生孢子梗產(chǎn)生于表面菌絲，壁光滑，帚狀枝為雙輪生、單輪生兼不規(guī)則生，分生孢子近球形至橢球形，壁粗糙，均為籃狀菌屬形態(tài)特征；M、N 所示菌落質(zhì)地絨狀，藍綠色，邊緣菌絲體白色，有些許淺黃色滲出液和可溶性色素，菌落反面呈淺黃褐色，分生孢子球形、近球形、橢圓形或近橢圓形；S、T 所示孢梗莖較細，壁薄，常具有隔膜，部分菌株孢梗莖頂端呈現(xiàn)不同程度膨大，是青霉屬的典型特征；O、P 所示菌落呈白色、粉紅色或紫色，菌絲無色或紫色，粗糙或光滑，分生孢子梗單生或聚集成孢梗束，可有幾級輪狀分枝；U、V 所示瓶?；恐鶢罨蚺虼?，向上變成細長頸部，分生孢子單胞或偶有雙細胞，光滑或粗糙，無色、紫色或綠色，形成離散的分生孢子鏈，是擬青霉屬的典型形態(tài)特征；Q、R 所示菌落最初為白色，進入產(chǎn)孢階段后菌落中間可見不同程度的綠色分生孢子堆，分生孢子梗單生或者聚集形成分生孢子梗座，排列緊密，呈帚狀分枝狀或輪生體狀；W 所示分生孢子呈長形至長橢圓形，無色，通過粘液連接形成平行排列的淡綠至橄欖綠柱狀孢子鏈，是綠僵菌屬典型形態(tài)特征。

2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

將供試菌株所擴增的ITS4、ITS5基因片段，通過Genious 7.1.4 軟件進行拼接，在NCBI 上采用BLAST 工具進行同源相似性搜索，在已發(fā)布序列中下載同源性高的序列，將已拼接序列和下載的同源序列進行多序列比對，使用MAGA-X 中最大似然法構(gòu)建Maximum Likelihood Tree（M-L 樹），如圖2 所示，66 株真菌共聚為7 大類，分別為刺束梗孢屬、白僵菌屬、蟲草屬、綠僵菌屬、青霉屬、擬青霉屬、籃狀菌屬。其中，菌株SCAULS28 與金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）聚為一枝，支持率為100%；菌株SCAUXT10、SCAUXT20、SCAUXT24、SCAUJY18、SCAUDX11、SCAUDX32 與淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）聚為一枝，支持率為97%；SCAUJH16、SCAULS26 聚為一枝，支持率98%；菌株SCAULS22 與Akanthomyces attenuatus，SCAULS3、SCAULS27、SCAULS37、SCAUXT6、SCAUXT9、SCAUXT22、SCAUXT29、SCAUJY27、SCAUJY39、SCAUJH7、SCAUNY27 與蟲草爪哇（Cordyceps javanica）聚為一枝，支持率為100%；菌株SCAULS1、SCAULS17、SCAULS30、SCAULS112、SCAULS222、SCAUXT15、SCAUJH19、SCAUDX37、SCAUNY28、SCAUXT16 球孢白僵菌（Beauveria bassiana）聚為一枝，支持率為100%；菌株SCAULS11、SCAULS38、SCAUXT11、SCAUXT25、SCAUJH36、SCAUDX2、SCAUDX38、SCAUDX19、SCAUDX32 與籃狀菌屬聚為一枝，支持率為100%；菌株SCAULS4、SCAUXT7、SCAUXT23、SCAUXT26、SCAUXT27、SCAUXT28、SCAUXT32、SCAUJY2、SCAUJH1、SCAUJH12、SCAUJH15、SCAUJH17、SCAUDX30、SCAUDX33、SCAUDX34、SCAUDX35、SCAUDX36、SCAUNY3、SCAUNY4、SCAUNY5、SCAUNY6、SCAUNY8、SCAUNY23、SCAUNY24、SCAUNY25、SCAULS29、SCAUDX1 與青霉屬聚為一枝，支持率為70%。由表1 可知，籃狀菌屬中包括柄籃狀菌（Talaromyces stipitatus）、馬爾尼菲藍狀菌（Talaromyces marneffei）、Talaromyces purpureogenus、Talaromyces verruculosus、Talaromyces pinophilus、Talaromyces oumae-annae；青霉屬中包括波蘭青霉（Penicillium polonicum）、Penicillium janthinellum、Penicillium sumatraense、橘青霉（Penicillium citrinum）、Penicillium brocae。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 菌株對斜紋夜蛾的致病力測定

如表2 所示，相同處理濃度，66 株蟲生真菌的致病力存在差異，當孢子懸浮液濃度為1×108CFU/mL時，處理第7 天各菌株引起的校正致死率在0～71.71%之間。與對照組相比，SCAUYZ16、SCAUJH19、SCAUXT15、SCAULS1、SCAULS112、 SCAULS17、SCAUDX37和SCAUNY28 等菌株的校正致死率表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05），其中菌株SCAUYZ16、SCAUJH19、SCAUXT15的校正致死率達50%以上，菌株SCAUYZ16 的校正致死率最高，為70.71%，其次是SCAUJH19，為57.84%。而菌株SCAULS30 等剩余菌株的校正致死率均低于17.31%，部分菌株對斜紋夜蛾二齡幼蟲的致死率微弱，未表1 中列出。SCAUYZ16、SCAUJH19、

表1 供試菌株分類鑒定結(jié)果

表2 供試菌株（1×108 個/mL）孢子懸浮液對斜紋夜蛾二齡幼蟲的第7 d 致死率

SCAUXT15、SCAULS1、SCAULS112、 SCAULS17、SCAUDX37 和SCAUNY28 等菌株對斜紋夜蛾2 齡幼蟲的侵染階段如圖3 所示。

圖3 斜紋夜蛾幼蟲感病狀

3 結(jié)論與討論

在永州農(nóng)業(yè)主產(chǎn)區(qū)采集土樣進行真菌分離純化，共獲得66 株菌株，依據(jù)《中國真菌志》[16-17]《真菌鑒定手冊》[18]等相關(guān)資料對所分離純化后的菌株進行形態(tài)觀察，并對66 株真菌菌株的ITS基因片段進行擴增，經(jīng)過測序及比對分析，用最大似然法聯(lián)合構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。綜合形態(tài)觀察和分子生物學(xué)的鑒定結(jié)果顯示，所獲得的66 株菌株可分類為7 屬12 種，分別為刺束梗孢屬的A.attenuatus，白僵菌屬的球孢白僵菌，蟲草屬的蟲草爪哇，綠僵菌屬的金龜子綠僵菌，青霉屬的波蘭青霉、橘青霉，擬青霉屬的淡紫紫孢菌，籃狀菌屬的柄籃狀菌、馬爾尼菲藍狀菌、T.verruculosus、T.pinophilus、T.oumae-annae。

另外，研究結(jié)果顯示，永州地區(qū)土壤中分離到的球孢白僵菌菌株在斜紋夜蛾防治中有很高的應(yīng)用潛力。該研究中，8 株球孢白僵菌菌株對斜紋夜蛾具備寄生性和致死性，用孢子懸浮液1.0×108CFU/mL 處理的第7 天，斜紋夜蛾2 齡幼蟲的校正死亡率為17.31%～70.71%；這與前人的研究結(jié)果相符。郭亞力等[19]研究球孢白僵菌MZ050724 菌株對斜紋夜蛾2 齡幼蟲的侵染效果，在3.0×108CFU/mL 孢子懸浮液中處理7 d后，斜紋夜蛾校正死亡率為68.18%；袁盛勇等[20]研究了球孢白僵菌 MZ041016 菌株對斜紋夜蛾4 齡幼蟲的侵染效果，在4.5 ×108CFU/mL 孢子懸浮液中處理8 d 后，斜紋夜蛾最高校正死亡率為85.87 %。以上結(jié)果表明從永州地區(qū)土壤中分離到的球孢白僵菌對斜紋夜蛾2 齡幼蟲有一定防治潛力，并且同種菌種的不同菌株有不同的致病效果。

該研究僅針對永州地區(qū)的斜紋夜蛾進行了菌株致病力檢測，尚未對其他害蟲進行致病力測試，暗示該菌株庫仍有潛在的有效菌株資源等待挖掘。通過此次對永州地區(qū)蟲生真菌資源的調(diào)查研究，既初步創(chuàng)建了該產(chǎn)地蟲生真菌資源庫，也為當?shù)氐暮οx生物防治奠定了基礎(chǔ)。