鄒劍鋒，郝晨星，湯 丹

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，湖南 長沙 410128）

柑橘黃龍?。℉uanglongbing，HLB）是世界柑橘生產(chǎn)上極具毀滅性的病害之一[1]。20 世紀初在中國的華南地區(qū)首先發(fā)現(xiàn)了柑橘黃龍病，隨后在福建、廣西、海南、 江西、 浙江、 四川、 云南、 貴州、 湖南和臺灣等地相繼發(fā)現(xiàn)。江西贛南地區(qū)于2010 年首次發(fā)現(xiàn)柑橘黃龍病，由于監(jiān)測預警未得到重視，導致近年來該地區(qū)柑橘黃龍病疫情異常嚴重，柑橘栽培面積已減少了近3 成。目前，湖南省的鄰近省份江西、廣東、廣西省的柑橘黃龍病疫情已經(jīng)相當嚴重，受害面積占柑橘栽培總面積的80%以上，之前湖南省只有永州地區(qū)出現(xiàn)零星的疫情，但截至2014 年底湘南地區(qū)均發(fā)現(xiàn)了木虱，各地相繼暴發(fā)柑橘黃龍病疫情。為促進全省柑橘產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，病害檢測和監(jiān)測預警工作刻不容緩。

黃龍病菌耐熱性亞洲種“CandidatusLiberibacter asiaticus”（CLas）是一種革蘭氏陰性菌，屬于α 變形菌綱[2]，是我國柑橘黃龍病的主要病原。目前，HLB 的檢測難度較大，一方面是因為CLas 主要存在于植株的韌皮部細胞中，難以培養(yǎng)，不能進行人工接種，以亞洲柑橘木虱作為媒介進行傳播[3]；另一方面是因為CLas 在植株內(nèi)分布不均勻，細菌滴度存在差異。同時，該病的潛育期和發(fā)病周期較長[4]也給HLB 的監(jiān)測增加了難度。

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，大量準確靈敏的分子檢測方法被用于HLB 病的檢測。常規(guī)PCR 檢測手段盡管成本低，但其檢出效率不高，易導致檢測結(jié)果的偏差，而實時熒光定量PCR（qPCR）檢測具有初始模板準確定量、靈敏度高、特異性強、閉管操作、簡便迅速等優(yōu)點[5]。早期對黃龍病菌的分子檢測主要聚焦于 HLB 菌的以下基因：16S rDNA、 β-操縱子和外膜蛋白基因。研究發(fā)現(xiàn)，用16S rDNA 和16S rRNA 進行定量分析的靈敏度要高于用β-操縱子的。因為16S rDNA 在CLas 基因組中有3 個拷貝，而16S rRNA 在CLas 基因組的拷貝數(shù)大約是16S rDNA 的7.8 倍[6]。隨著HLB 菌基因組測序工作的完成[7]，有學者將HLB 菌部分可檢測的原噬菌體基因應用于HLB 病害診斷和多態(tài)性分析等方面，并根據(jù)原噬菌體基因中的hyvI和hyvII基因分別設計了適用于SYBR Green Ⅰ法和探針法的real time 檢測引物LJ900r 和LJ900f。結(jié)果表明，該基因包含多個串聯(lián)重復序列，是qPCR 檢測中理想的目的基因擴增區(qū)域[8]。

近期，湖南柑橘脫毒中心建立并優(yōu)化了柑橘黃龍病qPCR 的檢測體系，為柑橘黃龍病的早期診斷及鑒定提供了特異準確、靈敏快速的檢測體系。筆者選取8 對根據(jù)CLas 菌DNA 不同保守區(qū)域設計的擴增引物，分別利用常規(guī)PCR 和qPCR 體系對柑橘HLB 病原進行檢測，對2 種檢測體系的靈敏度和檢出率進行比較。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 柑橘葉片樣品和陽性對照11 個柑橘HLB 疑似樣品由湖南省郴州市汝城縣農(nóng)業(yè)局提供，取新鮮葉片液氮冷凍后置于-80℃冰箱保存，待檢。以含有HLB 菌16S rDNA 重組質(zhì)粒（濃度為98 ng/μL）的10倍梯度稀釋液作為HLB 陽性對照。

1.1.2 常規(guī)PCR 引物使用LB1/LB2、In1/In2、OL1/OL2、OI1/OI2 這4 對引物進行常規(guī)PCR 檢測，引物由生工生物工程股份有限公司合成，具體信息見表1[9]。

1.1.3 qPCR 引物qPCR 因為包括用于特異性結(jié)合HLB 菌hyv I 和hyv II 序列的引物LJ900f/LJ900r，以及用于擴增HLB 菌種16S rDNA 的引物Las-I-F/Las-I-R、Las-O-F/Las-O-R、HLBas/HLBr，引物由生工生物工程股份有限公司合成，具體信息見表1。

表1 引物信息

1.2 試驗方法

1.2.1 常規(guī)PCR 反應體系和反應程序（1）反應體系（25 μL）：Taq 酶0.4 μL，10 μmol/L 引物各0.4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.4 μL，Taq Buffer 2 μL，DNA 模 板 1 μL，ddH2O 補足至25 μL。（2）反應程序：94℃預變性3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.2 qPCR 反應體系和反應程序（1）反應體系（20 μL）：SYBG premix taq 10 μL，10 μmol/L 引 物 各0.4 μL，DNA 模 板 1 μL，ddH2O 補 足至20 μL。（2）反應程序：95℃預變性2 min；95℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共40 個循環(huán)；擴增結(jié)束后進行熔解曲線分析，用于驗證擴增的特異性。

1.2.3 靈敏度檢測將黃龍病菌重組質(zhì)粒DNA（母液 濃 度 為98 ng/μL）按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8進行梯度稀釋，稀釋后質(zhì)粒DNA 濃度依次為9.8 ng/μL、980 pg/μL、98 pg/μL、9.8 pg/μL、980 fg/μL、98 fg/μL、9.8 fg/μL、0.98 fg/μL，以此為擴增模板分別進行常規(guī)PCR 擴增和qPCR 擴增，分析2種檢測體系的檢測下限。

1.2.4 特異性檢測在田間選取葉片黃化斑駁的疑似黃龍病植株樣品11 個，分別提取核酸，用于檢測各引物的特異性，按照上述方法分別進行常規(guī)PCR 檢測和qPCR 檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)PCR 各引物的檢測效果

使用HLB 菌16S rDNA 特異性引物LB1/LB2、In1/In2、OL1/OL2、OI1/OI2 對梯度稀釋的HLB 菌重組質(zhì)粒陽性樣品進行擴增，結(jié)果如圖1 所示，In1/In2引物未擴增出目的條帶（圖1A），LB1/LB2（圖1B）、OL1/OL2（圖1C）和OI1/OI2（圖1D）引物對稀釋10-1、10-2和10-3的HLB 菌重組質(zhì)粒陽性樣品均擴增出目的條帶。這表明4 組引物中，LB1/LB2、OL1/OL2、OI1/OI2 引物對HLB 菌濃度檢測的下限為98 pg/μL。從擴增條帶的亮度來看，OI1/OI2 這組引物的擴增效果最好。

圖1 4 對引物在柑橘HLB 菌常規(guī)PCR 體系的靈敏度檢測

2.2 qPCR 各引物的檢測效果

使用SYBG Green 染料法對梯度稀釋的陽性樣品進行實時熒光定量擴增，結(jié)果見圖2～5。采用Las-O-r/Las-O-f（圖2）和HLBas/HLBr（圖4）這2 組引物對10-1、10-2、10-3濃度的陽性樣品擴增，均能出現(xiàn)明顯的熒光累積而使熒光值達到閾值以上，熔解曲線分析結(jié)果也顯示擴增產(chǎn)物具有單一性；利用Las-I-r/Las-I-f（圖3）和LJ900r/LJ900f（圖5）這2 組引物對10-1、10-2、10-3、10-4濃度的陽性樣品擴增，均能出現(xiàn)明顯的熒光累積而使熒光值達到閾值以上，熔解曲線分析結(jié)果也顯示擴增產(chǎn)物具有單一性。在qPCR 檢測體系中，Las-I-r/Las-I-f 和LJ900r/LJ900f 的檢測靈敏度較好，其檢測下限為9.8 pg/μL。

圖2 引物Las-O-r/Las-O-f 在qPCR 體系中的檢測靈敏度分析

圖3 引物Las-I-r/Las-I-f 在qPCR 體系中的檢測靈敏度分析

圖4 引物HLBas/HLBr 在qPCR 體系中的檢測靈敏度分析

2.3 田間樣品的HLB 鑒定

對郴州市汝城縣農(nóng)業(yè)局送檢的11 個HLB 疑似樣品分別進行常規(guī)PCR 擴增（引物為OI1/OI2）和qPCR 擴增（引物為LJ900r/LJ900f）。常規(guī)PCR 檢測結(jié)果（圖6）顯示，樣4、樣8、樣9、樣10 和樣11這5 個樣品均擴增出明顯的目的條帶，其中樣10 的擴增產(chǎn)物條帶較為微弱模糊。

圖6 常規(guī)PCR 對田間樣品的HLB 檢測

qPCR 結(jié)果（圖7）顯示，樣3、樣4、樣5、樣7、樣8、樣9、樣10、樣11 這8 個樣品的熒光累積達到閾值以上，且熔解曲線分析結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物具有單一性。

圖7 qPCR 對田間HLB 疑似樣品的檢測結(jié)果

綜合比較2 種檢測體系發(fā)現(xiàn)，對同一批次11 個樣品，采取常規(guī)PCR 檢測，5 個樣品呈陽性，HLB的檢出率為45.5%；而采取qPCR 檢測，8 個樣品呈陽性，HLB 的檢出率為72.7%（表2）。

表2 2 種檢測體系對田間樣品檢測結(jié)果的比較

3 結(jié)論與討論

由于HLB 菌在樹體上分布不均勻，且具有較長的潛伏期，樹體感染黃龍病菌后較長時間內(nèi)不會顯示癥狀，同時病菌濃度與病害的嚴重程度并不嚴格地呈對應關系。因此，柑橘HLB 的準確檢測難度較大。加上樣品本身所含背景DNA 的干擾（HLB 病菌DNA濃度所占比例較低），導致檢測時容易出現(xiàn)不可靠的結(jié)果[10]。

目前，HLB 檢測主要是通過擴增拷貝數(shù)較低的16S rDNA 保守區(qū)域來進行的。該研究共選取了8 對引物進行HLB 檢測，其中LB1/LB2、In1/In2、OL1/OL2、OI1/OI2、Las-O-r/Las-O-f、HLBas/HLBr、Las-I-r/Las-I-f 是根據(jù)16S rDNA 保守區(qū)域設計的上下游引物，LJ900r/LJ900f 是根據(jù)噬菌體中高拷貝數(shù)hyv I/hyvII保守區(qū)域設計的上下游引物[11]。

在靈敏度試驗中，將已經(jīng)定量的含有HLB 菌16S rDNA 的重組質(zhì)粒的梯度稀釋液作為陽性模板，分別進行常規(guī)PCR 和qPCR 擴增，結(jié)果顯示，常規(guī)PCR 供試的4 組引物中，In1/In2 引物未擴增出目的條帶，其他3 組引物的靈敏度由高到低排列依次為OI1/OI2 ＞LB1/LB2= OL1/OL2，OI1/OI2 這組引物對HLB菌的檢測下限為98 pg/μL；qPCR 供試的4 組引物的靈敏度由高到低排列依次為LJ900f/LJ900r ＞Las-I-f/Las-I-r ＞HLBas/HLBr ＞Las-O-f/Las-O-r（根據(jù)可檢測到最低濃度樣本的Ct 值排序），其中LJ900f/LJ900r這組引物對HLB 菌的檢測下限為9.8 pg/μL。

對11 個田間疑似HLB 樣品的檢測結(jié)果顯示，LJ900r/LJ900f 這組引物的檢出率為72.7%，OI1/OI2 這組引物的檢出率為45.5%。這表明引物LJ900r/LJ900f結(jié)合qPCR 方法對于HLB 菌的檢測效率更高。

目前，HLB 的分子檢測方法主要有常規(guī)PCR 檢測和qPCR 檢測，該研究通過分析對比2 種檢測方法的靈敏度發(fā)現(xiàn)，qPCR 的檢測結(jié)果相對常規(guī)PCR 的更為可靠、靈敏、快速。qPCR 檢測所用引物以根據(jù)噬菌體中高拷貝數(shù)hyv I/hyv II保守區(qū)域設計的上下游引物LJ900r/LJ900f 具有更好的檢測效率。

隨著人們對HLB 菌基因組信息剖析的進一步深入，將會有更多可利用的標記基因或序列用于其分子檢測，不同標記的適用普遍性和特異性（可能因寄主、地域來源、樣品濃度、純度等而異）也會有更深入地探討。