黨海月，張妮妮，朱明旗，王 妍，逯 茜，王思敏 ，梁曉飛，張 榮，鄒養(yǎng)軍，查養(yǎng)良，張志林，孫廣宇

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.陜西省咸陽市園藝站，陜西咸陽 712000；4.陜西省永壽縣園藝站，陜西永壽 713400)

蘋果是中國農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，對農(nóng)民的收入及脫貧致富具有重要作用。蘋果花臉病和銹果病是由蘋果銹果類病毒(Apple skin scar viroid，ASSVd)引起的類病毒病害，主要危害蘋果果實，表現(xiàn)為“花臉”或“銹果”癥狀，果面著色不均、凹凸不平，或形成鐵銹色病斑。該類病害不僅降低果實品質(zhì)，而且直接影響商品價值，因而危害巨大，給果農(nóng)造成嚴重的經(jīng)濟損失[1-2]。該類病害在山東、陜西、山西、遼寧、北京和黑龍江等蘋果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，在國內(nèi)蘋果主產(chǎn)區(qū)具有逐年增加的趨勢，嚴重威脅蘋果產(chǎn)業(yè)的安全與可持續(xù)發(fā)展[3-4]。類病毒是目前發(fā)現(xiàn)的最小的致病生物，對農(nóng)作物造成巨大的危害[5]。類病毒病的控制是一個重要的難題，目前缺乏有效防治該病害的化學(xué)藥劑。采用無毒苗木是控制類病毒發(fā)生及危害的最有效途徑。在中國，由于尚沒有無毒苗木使用的法規(guī)或條例，致使生產(chǎn)實踐中采用無毒苗建園的比例較低，因而病毒和類病毒病害發(fā)生普遍。

植物免疫誘抗劑不直接殺死病菌或病毒，可以通過激活植物的防御反應(yīng)，增強植物自身抗病水平，從而預(yù)防或減輕病害發(fā)生。利用蛋白誘抗劑誘導(dǎo)植物抗病性控制農(nóng)作物病害，是一種新的病害防控手段。新型蛋白誘抗劑阿泰靈是由3%氨基寡糖和3%極細鏈格孢(Alternariatenuissima)激活蛋白配合而成的抗病毒蛋白質(zhì)生物農(nóng)藥，主要通過蛋白激發(fā)子PeaT1和Hrip1激活植物的免疫系統(tǒng)并調(diào)節(jié)植物的新陳代謝，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，提高相關(guān)抗病基因的表達[6]。阿泰靈對水稻條紋葉枯病、番茄黃化曲葉病、油菜菌核病等多種病害表現(xiàn)出良好的抗病作用[6-7]，但阿泰靈對蘋果花臉病或銹果病的作用尚不清楚。植物病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-related protein，PR蛋白)在病原物侵染及化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)下產(chǎn)生，使植物獲得系統(tǒng)性抗性[8]。阿泰靈可以提高PR1、PR2和PR5等抗病相關(guān)基因在小麥中的轉(zhuǎn)錄表達水平，促進PR蛋白的產(chǎn)生可能是其提高寄主抗病性的重要作用機制之一[9]。

為探索新型蛋白誘抗劑阿泰靈防治蘋果銹果類病毒病害的可能性，本研究分別在‘富士’‘G20’優(yōu)系及‘秦蜜’等品種上開展田間防治效果試驗，進而通過PR蛋白基因的表達分析其抗病機制，以期為蘋果類病毒病害防治提供一種新途徑。

1 材料與方法

1.1 田間果樹選擇與標記

2017年7月于旬邑果園調(diào)查患有蘋果花臉病果樹，病果率在80%以上，品種為‘G20’優(yōu)系，品種特性為早熟品種，樹齡4 a，對病樹用油漆進行標記。

2017年9月于乾縣果園調(diào)查患有蘋果花臉病果樹，病果率為20%～50%，選擇病果率50%左右果園，品種為‘富士’，樹齡15 a，對病樹用油漆進行標記。

2017年9月于洛川果園調(diào)查患有蘋果銹果病果樹，病果率在80%以上，品種為‘秦蜜’，樹齡 6 a，對病樹用油漆進行標記。

1.2 阿泰靈田間藥劑處理方法

藥劑處理方法：根灌結(jié)合葉面噴灑處理，每顆樹為1個處理，重復(fù)5～8次。阿泰靈為處理組，高嶺土為對照組，處理與對照在同一行，自然分布。

根灌處理：于樹體東、西、南、北4個方向挖4個30 cm坑，阿泰靈劑量為每棵15 g，用2 kg水將15 g阿泰靈制劑溶解，均勻倒入4個坑中。

葉面噴施：用濃度為1 g/kg的阿泰靈噴灑葉片，每棵樹噴灑2 kg。

處理時間：‘G20’優(yōu)系為2017年10月上旬、2018年3月下旬、4月下旬和5月下旬；‘富士’與‘秦蜜’品種為2017年10月上旬、2018年4月下旬、5月下旬和6月下旬。

1.3 病害發(fā)生程度調(diào)查及分析方法

調(diào)查時間：‘G20’優(yōu)系為2018年7-9月；‘富士’與‘秦蜜’品種為2018年10月。

病果分級方法：對于花臉癥狀，病斑面積占果面面積10% 以下，為商品果，病斑面積占果面面積10% 以上，為病果；對于銹果癥狀，無論面積大小，出現(xiàn)銹果癥狀即按照病果統(tǒng)計。Student’st檢驗用于顯著性分析(P<0.05)。

病果率= 病果數(shù)/果實總數(shù)×100%

防治效果= (對照組病果率-處理組病果率)/對照組病果率×100%

1.4 愈傷組織培育及處理

田間選取1 a生冬季休眠枝條，室內(nèi)水培法培養(yǎng)，待枝條長出新芽約2 cm時，將其取下進行消毒；將消毒好的芽置于初代培養(yǎng)基上生長，及時去除污染及嚴重褐化的芽；將無污染的芽多次更換培養(yǎng)基，之后1個月即可獲得蘋果組培苗；將蘋果組培苗的葉片切成4～6塊，在誘導(dǎo)愈傷組織形成培養(yǎng)基暗培養(yǎng)15 d和光培養(yǎng)15 d交替處理獲得蘋果愈傷組織。

選取長勢一致的愈傷塊，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，每培養(yǎng)皿放置4塊愈傷。將阿泰靈稀釋1 000倍并用細菌過濾器過濾，用250 μL阿泰靈稀釋液處理愈傷塊；對照組用同體積的無菌水處理。選取0 h、12 h、24 h、36 h、48 h及60 h共6個時間點，試驗重復(fù)3次。用滅菌的錫箔紙將樣品包裹，迅速置于液氮中冷凍，置于-80℃冰箱中冷藏。

1.5 qRT-PCR檢測病程相關(guān)蛋白基因表達量

RNA提取參照RNApre Pur多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)的方法。cDNA合成參照5′Integrated RT MasterMi試劑盒的方法。從GenBank下載蘋果病程相關(guān)蛋白序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計病程相關(guān)蛋白基因引物(表1)，引物序列由奧科生物科技有限公司合成。以蘋果Actin基因作為內(nèi)參基因[10]。用 qRT-PCR檢測基因的轉(zhuǎn)錄水平，反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s；35個循環(huán)數(shù)； 72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存；反應(yīng)體系(10 μL)：2′RealStar Green Power Mixture 5 μL，ROX Reference Dye(50×)0.2 μL，cDNA模板0.2 μL，正、反向引物各0.2 μL，RNase-free H2O 4.2 μL。試驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法計算相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿泰靈對蘋果花臉病的防治效果

對于‘富士’品種，試驗結(jié)果顯示，阿泰靈處理組病果率為4.1%，對照組病果率為49.6%，防治效果為91.7%(圖1)?！瓽20’優(yōu)系為早熟品種，7月中下旬成熟。在7月24日成熟期調(diào)查，結(jié)果顯示，阿泰靈處理組病果率為7.2%，對照組病果率為93.0%，防治效果為92.3%；果實成熟期過以后，在8月10日調(diào)查，結(jié)果顯示，阿泰靈處理組病果率為93.0%，對照組病果率為100%，阿泰靈處理組與對照組病果率差異不大(圖2)。‘秦蜜’品種感染類病毒后輕者表現(xiàn)為花臉癥狀，嚴重時表現(xiàn)為銹果癥狀。試驗結(jié)果顯示，阿泰靈處理組銹果癥狀顯著變輕或消失，但仍可表現(xiàn)為花臉，對表現(xiàn)花臉癥狀的果實仍然按照病果對待。調(diào)查顯示阿泰靈處理組病果率為25.3%，對照組病果率為77.3%，防治效果為67.3%(圖3)。上述試驗結(jié)果表明：阿泰靈處理對花臉型和銹果型均具有顯著防治效果。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

圖2 阿泰靈處理‘G20’優(yōu)系花臉病發(fā)病情況Fig.2 The incidence of apple skin scar viroid on strain ‘G20’ treated by Atailing

2.2 阿泰靈防治蘋果花臉病的機制

采用稀釋1 000倍的阿泰靈處理蘋果愈傷組織，分析其病程相關(guān)蛋白基因的表達量，結(jié)果顯示，在0～60 h，PR1a基因明顯上調(diào)表達，60 h時相對表達量最大，是對照組0 h表達量的5.0倍(圖4)；在24～60 h，PR8基因明顯上調(diào)表達，48 h時相對表達量最大，為對照組0 h表達量的41.2倍(圖5)；在36～60 h，PR10a基因明顯上調(diào)表達，48 h時相對表達量最大，是對照組0 h表達量的7.8倍(圖6)；在12～24 h及48～60 h，PR10b基因明顯上調(diào)表達，24 h時相對表達量最大，是對照組0 h表達量的7.4倍(圖7)；在36～60 h，PR10c基因明顯上調(diào)表達，60 h時相對表達量最大，是對照組0 h表達量的7.9倍(圖8)；在24～60 h，PR10 d基因明顯上調(diào)表達，48 h時相對表達量最大，是對照組0 h表達量的9.6倍(圖9)；在48～60 h，DEF1基因輕微上調(diào)表達，60 h時相對表達量最大，是對照組0 h表達量的3.9倍(圖10)。表明阿泰靈可以顯著誘導(dǎo)多種病程相關(guān)蛋白基因的表達，可能通過誘導(dǎo)這些基因表達提高蘋果對類病毒的抗病性。

圖3 阿泰靈處理‘秦蜜’品種銹果病發(fā)病情況Fig.3 The incidence of apple skin scar viroid on variety ‘Qinmi’ treated by Atailing

圖4 不同時間點 PR1a基因相對表達量Fig.4 Relative expression of PR1a gene in apple callus at different time points

圖5 不同時間點 PR8基因相對表達量Fig.5 Relative expression of PR8 gene in apple callus at different time points

圖6 不同時間點 PR10a基因相對表達量Fig.6 Relative expression of PR10a gene in apple callus at different time points

圖7 不同時間點 PR10b基因相對表達量Fig.7 Relative expression of PR10b gene in apple callus at different time points

圖8 不同時間點 PR10c基因相對表達量Fig.8 Relative expression of PR10c gene in apple callus at different time points

圖9 不同時間點 PR10d 基因相對表達量Fig.9 Relative expression of PR10d gene in apple callus at different time points

圖10 不同時間點 DEF1 基因相對表達量Fig.10 Relative expression of DEF1 gene in apple callus at different time points

3 結(jié)論與討論

已有研究表明，阿泰靈對烤煙、蔬菜等病毒病有較好防治效果[11]。本研究通過果園防治試驗，顯示阿泰靈對蘋果類病毒病也具有一定防治效果：對‘富士’品種花臉病的防治效果為91.7%；對‘G20’品系花臉病在成熟期的防治效果為92.3%，對‘秦蜜’品種銹果病的防治效果為67.3%。整體來看，對于‘富士’品種的花臉病防治效果較好，對于‘G20’品系在正常成熟時期防治效果較好，但過了成熟期未采摘則花臉癥狀加重；對于表現(xiàn)銹果癥狀的品種，可以顯著消除銹果癥狀的表現(xiàn)，但仍會表現(xiàn)一定的花臉癥狀。說明阿泰靈在生產(chǎn)上具有一定的應(yīng)用價值。但在試驗期間，果樹大小年、品種、成熟期、及田間施肥條件等對防治結(jié)果有一定的影響。因此，對不同品種的用藥優(yōu)化、阿泰靈結(jié)合施肥進一步提高防效等有待繼續(xù)研究。

愈傷組織個體間差異比小，長勢一致性高，是替代田間果樹的優(yōu)異試驗材料。PR蛋白分為17個家族[12]，其中PR1a為抗真菌蛋白，PR8具有幾丁質(zhì)酶活性和抗真菌活性；PR10具有核酸酶和體外抗菌活性；DEF1屬于PR12蛋白，在煙草中具有抗病毒活性。本試驗表明，阿泰靈處理組的PR1a、PR8、PR10a、PR10b、PR10c、PR10d及DEF1蛋白基因不同程度上調(diào)表達，對PR8基因的誘導(dǎo)上調(diào)最顯著，其次是PR10蛋白基因。PR蛋白的積累不僅提高了寄主抗病性，也有可能會影響植物生理狀態(tài)進而影響病毒在植物體內(nèi)的狀態(tài)[13]。結(jié)合阿泰靈對田間蘋果花臉病和銹果病的防治效果，推測阿泰靈可能通過誘導(dǎo)蘋果果樹生成大量PR蛋白，進而提高其對ASSVd的抗病性。阿泰靈對蘋果花臉病的防治作用可能存在多種機制，有待進一步探索。