曾凡松，史文琦，向禮波，薛敏峰，袁 斌，龔雙軍，楊立軍

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中作物有害生物綜合治理重點實驗室，武漢 430064；2.農(nóng)作物重大病蟲草害防控湖北省重點實驗室，武漢 430064；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學院 植保土肥研究所，武漢 430064)

由禾谷類白粉菌小麥?；?Blumeriagraminisf.sp.tritici，Bgt)引起的小麥白粉病危害葉片、莖稈和麥穗，影響光合作用和籽粒灌漿，導致產(chǎn)量損失，給小麥生產(chǎn)造成嚴重威脅。小麥白粉病在中國常年發(fā)生面積685萬～730萬hm2，一般發(fā)病田減產(chǎn)5%～10%，重病田減產(chǎn)達20%以上[1]。小麥白粉菌是專性活體寄生真菌，分生孢子是其生活史中無性世代的繁殖體，也是白粉病流行的重要侵染源。禾谷類白粉菌分生孢子降落到葉片上2 h后即可萌發(fā)，24 h后可成功侵入小麥，3 d后長出大量菌絲，4 d后在菌絲上形成足細胞，5 d后從足細胞上分化出分生孢子梗，6 d后能產(chǎn)生大量分生孢子，并隨氣流遠距離傳播，使病害快速蔓延[2-3]。因此，研究調(diào)控白粉菌分生孢子形成基因，將有助于了解白粉菌無性產(chǎn)孢的分子機制，為控制白粉病的流行提供依據(jù)。

14-3-3蛋白是一類廣泛存在于真核生物中且功能上高度保守的酸性二聚體蛋白，它們在細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導、基因表達調(diào)控和蛋白質(zhì)聚集等生物學過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。14-3-3蛋白的功能與真菌的生長發(fā)育、無性或有性繁殖、初生或次生代謝、對脅迫的響應以及毒性等密切相關(guān)，例如釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、球孢白僵菌(Beauveriabassiana)和靈芝(Ganodermalucidum)的Bmh1和Bmh2及其同源蛋白，以及裂殖酵母菌(Schizosaccharomycespombe)的RAD24和RAD25，這些蛋白因缺少催化結(jié)構(gòu)域，主要通過與其他蛋白互作來調(diào)控細胞信號轉(zhuǎn)導、基因表達和蛋白質(zhì)修飾過程[6-10]。蛋白互作研究表明14-3-3蛋白與其他蛋白的互作依賴于特定氨基酸的磷酸化，能與14-3-3蛋白發(fā)生特異性互作的蛋白幾乎涉及所有細胞過程，這使得14-3-3蛋白成為互作網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點[11-13]。目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于白粉菌14-3-3蛋白結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)報道，大麥白粉菌基因組注釋發(fā)現(xiàn)3個預測的14-3-3蛋白(NCBI 登錄號：CCU79787.1、CCU76816.1和CCU78877.1)[14]，在小麥白粉菌基因組注釋中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)信息[15]。

由于白粉菌是專性活體寄生菌，不能在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，無法進行遺傳轉(zhuǎn)化，導致基因功能研究進展緩慢。本研究采用生物信息學和分子生物學方法對小麥白粉菌1個14-3-3蛋白進行序列分析、功能預測和突變位點檢測，對該基因在白粉菌分生孢子形成階段的表達動態(tài)進行監(jiān)測，為進一步研究該蛋白在小麥白粉菌無性產(chǎn)孢過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株的保存和擴繁

供試菌株為Bgt21-2，于2011年采自江蘇省鹽城市，由湖北省農(nóng)業(yè)科學院植保土肥研究所植物病理實驗室分離和保存[16]。將小麥材料Chancellor的種子播種在含有營養(yǎng)土的塑料缽(20 cm×20 cm)中，(18±1) ℃、相對濕度70%、72 μmol·m-2·s-1光照16 h、黑暗8 h持續(xù)培養(yǎng)10 d。按照Zeng等[16]報道的方法將菌株Bgt21-2接種到小麥材料‘Chancellor’的離體葉段上，(17±1) ℃、72 μmol·m-2·s-1持續(xù)光照培養(yǎng)，每12 d擴繁1次。

1.2 14-3-3蛋白編碼基因序列的獲取

以大麥白粉菌(B.graminisf.sp.hordei)14-3-3蛋白(NCBI登錄號為CCU79787.1)為查詢序列，在小麥白粉菌菌株96224蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行BLASTp搜索(參數(shù)設(shè)置：E-value=1e-10)，獲得小麥白粉菌含有的候選14-3-3蛋白。采用BWA軟件[17]將菌株Bgt21-2產(chǎn)孢階段轉(zhuǎn)錄組reads[18]匹配到菌株96224基因組[15]，用整合的基因組查看軟件(IGV)[19]獲得覆蓋候選蛋白基因開放閱讀框(ORF)的cDNA序列。 根據(jù)此序列中5′非翻譯區(qū)和3′非翻譯區(qū)，采用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計特異性引物，送上海英駿生物科技有限公司合成。

將菌株Bgt21-2接種到感病品種‘Chanceller’離體葉段上，采用5%醋酸纖維素包埋法[20]在接種后5 d(5 day post inoculation, 5 dpi)取葉表面菌體樣品(不含葉組織)，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用RNA-iso plus試劑盒(TAKARA, Japan)和PrimeScriptTMcDNA合成試劑盒(TAKARA, Japan)進行總RNA的提取和 cDNA的合成。以上述cDNA為模板和特異性引物進行PCR擴增，獲得包含完整ORF的目標基因片段。PCR反應體系50 μL，包括模板DNA 2.5 μL，ddH2O 35.75 μL，10×ExTaqPCR Buffer (TAKARA, Japan)5.0 μL，50 mmol·L-1Mg2+2.50 μL，10 mmol·L-1dNTPs 1.25 μL，上游和下游引物各1.25 μL，ExTaq酶(TAKARA, Japan)0.50 μL。 反應程序為95 ℃, 10 min；40個循環(huán)：95 ℃, 10 s; 55 ℃, 30 s; 72 ℃, 2.5 min；72 ℃ 10 min。將擴增產(chǎn)物用Genview DNA回收試劑盒(北京鼎國昌盛生物科技有限公司)純化后連接到T-easy載體(TAKARA, Japan)，并送上海生工生物科技有限公司測序。采用DNAMAN v6.0和NCBI ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進行序列分析。為檢測目標基因在自然群體菌株中的變異，收集菌株分生孢子樣品，采用SP真菌DNA提取試劑盒(OMEGA，USA)提取菌株基因組DNA。以基因組DNA為模板，用上述特異性引物進行PCR擴增，PCR程序、產(chǎn)物連接、測序及序列比對方法與cDNA擴增部分相同。

其他物種的14-3-3蛋白質(zhì)序列均來自NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。以下生物信息學分析均采用默認參數(shù)，自定義參數(shù)另行說明。

1.3 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和氨基酸序列分析

采用ProtParam軟件[21](https://web.expasy.org/protparam/)計算蛋白質(zhì)的長度、分子質(zhì)量和理論等電點。采用ProtScale軟件[21](https://web.expasy.org/protscale/)對蛋白質(zhì)的親水性/疏水性進行分析。分別利用SignalP v5.0 Server[22](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、BUSCA[23](http://busca.biocomp.unibo.it/)和TMHMM v2.0[24](http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線服務(wù)器對信號肽、亞細胞定位和跨膜區(qū)進行預測。

1.4 蛋白質(zhì)功能注釋和結(jié)構(gòu)分析

采用BLASTp將目標蛋白質(zhì)序列與GO(Gene Ontology)、SwissProt、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、Reactome、NCBI nr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得蛋白的功能注釋。利用SMART在線工具[25]、NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫[26](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)和InterPro數(shù)據(jù)庫[27](http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)預測蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域。采用Motif Scan在線工具[21](https://myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan/)進行模體分析。采用I-TASSER蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在線預測工具[28]預測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)和與其他蛋白的互作位點。

1.5 多重序列比對和系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建

用BLASTp程序，以目標蛋白質(zhì)序列為查詢序列，在NCBI nr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索并下載同源序列或者已知14-3-3蛋白質(zhì)序列進行比對。多比對分析和作圖通過Clustal-X v2.0.11軟件[29]和DNAMAN v6.0軟件實現(xiàn)。利用MEGA v6.0軟件[30]和鄰接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并采用bootstrap法進行檢驗(1 000次重復)。

1.6 qRT-PCR擴增和表達譜分析

將菌株Bgt21-2接種到小麥材料‘Chancellor’的離體葉段上，根據(jù)Yang等[3]報道的方法在3 dpi、4 dpi和5 dpi取葉片進行臺盼藍染色。同時采用“1.2”中描述的方法分別在3個時間點收集葉表面菌體樣品，提取總RNA，合成cDNA。每時間點設(shè)置3次生物學重復。

采用實時熒光定量PCR技術(shù)對BgtFTT1基因在不同發(fā)育時間點的相對表達量進行測定。根據(jù)目標基因的ORF序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物(表1)。引物序列由上海英駿生物科技有限公司合成。用SYBR GREEN PCR Kit (Life Technologies, USA)配制反應體系。PCR反應程序為：95 ℃, 10 min；40個循環(huán)：95 ℃, 10 s; 60 ℃, 30 s; 65～95 ℃收集熔解曲線。PCR反應在ABI 7500 real-time PCR儀上完成，所有PCR樣品重復3次。以小麥白粉菌β-微管蛋白基因作為內(nèi)參基因[20]。分別將4 dpi和5 dpi時的表達量與3 dpi時的表達量進行比較，采用2-ΔΔCT方法[31]計算基因相對表達量。采用student’s t-test進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥白粉菌14-3-3蛋白編碼基因 BgtFTT1的克隆

在小麥白粉菌96224蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)1個14-3-3蛋白(NCBI登錄號： EPQ65962.1)。菌株Bgt21-2轉(zhuǎn)錄組reads覆蓋了菌株96224參考基因組第5染色體的12 863 213～12 865 699 bp之間的區(qū)域，且reads覆蓋呈連續(xù)分布，說明該基因沒有內(nèi)含子存在。以cDNA為模板的特異性PCR 擴增，獲得了長度為1 181 bp的cDNA序列。該cDNA兩端分別處在5′非翻譯區(qū)和3′非翻譯區(qū)，中間跨越1條長度為891 bp的完整ORF序列，與菌株96224中的相應序列完全一致。該基因編碼296個氨基酸的蛋白，暫定名為BgtFTT1。

表1 用于 BgtFTT1基因序列擴增和基因表達分析的引物Table 1 Primers used for amplification of BgtFTT1 sequence and its expression analysis

2.2 BgtFTT1蛋白的理化性質(zhì)分析

BgtFTT1蛋白預測的分子質(zhì)量為34.18 ku，理論等電點值為8.51，屬堿性蛋白質(zhì)(表2)。 BgtFTT1親水性氨基酸比疏水性氨基酸多，屬親水性蛋白，序列C端的第269～278位氨基酸殘基親水性最強，其次是靠近N端的第42～50位和第69～77位。

表2 BgtFTT1蛋白生物信息學特征Table 2 Bioinformatic characteristics of BgtFTT1

2.3 BgtFTT1蛋白的序列特征和功能注釋

序列分析表明， BgtFTT1不含信號肽和跨膜螺旋，預測的亞細胞定位在細胞質(zhì)(表2)。BgtFTT1包含5個蛋白激酶C 磷酸化位點、2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、1個N-?；稽c、 1個糖基化位點、1個酪氨酸磷酸化位點和1個七殘基重復模體(圖1)。從大麥白粉菌、山茱萸白粉菌(Erysiphepulchra)和葡萄白粉菌(E.necator)中各找到1個與BgtFTT1同源的蛋白，除七殘基重復模體外，11個模體序列在這些14-3-3同源蛋白中均相對保守(圖1)。

大麥白粉菌、山茱萸白粉菌和葡萄白粉菌14-3-3蛋白NCBI登錄號分別為：CCU79787.1、 POS86779.1、KHJ34528.1；紅色、桔色、綠色、藍色、紫色和灰色下劃線分別表示N-?；稽c、N-糖基化位點、酪蛋白激酶磷酸化位點、蛋白激酶C磷酸化位點、酪氨酸激酶磷酸化位點和七殘基重復等6種模體的位置

BgtFTT1在GO、KEGG和Swissprot數(shù)據(jù)庫中均未獲得其相關(guān)注釋信息，是一個假定蛋白。BgtFTT1含有保守的14-3-3結(jié)構(gòu)域(位置：第205-277位氨基酸，SMART登錄號：SM000101)，屬于14-3-3蛋白質(zhì)家族(IPR000308)，14-3-3蛋白質(zhì)超級家族(IPR036815)。從reactome數(shù)據(jù)庫中找到5個與這一蛋白質(zhì)家族成員功能相關(guān)的通路，其中2個通路與Ca2+信號通路有關(guān)(R-HSA-111447、R-HSA-5625740)，2個通路與糖代謝和能量代謝有關(guān)(R-HSA-1445148、R-HSA-5628897)，1個通路與細胞周期有關(guān)(R-HSA-75035)(表3)。

表3 BgtFTT1蛋白在Reactome數(shù)據(jù)庫中的注釋結(jié)果Table 3 Annotation of BgtFTT1 from the Reactome database

2.4 BgtFTT1蛋白的高級結(jié)構(gòu)分析

二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果表明，BgtFTT1包含α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角等4種二級結(jié)構(gòu)。α-螺旋是占比最大的二級結(jié)構(gòu)(51.4%)，其次是無規(guī)則卷曲(38.2%)，占比最小的是β-轉(zhuǎn)角(3.4%)。來自大麥白粉菌等其他白粉菌的同源蛋白均與BgtFTT1存在相似的二級結(jié)構(gòu)特征。其中大麥白粉菌14-3-3蛋白(CCU79787.1)具有與BgtFTT1幾乎完全相同的α-螺旋結(jié)構(gòu)(圖2)。BgtFTT1整個蛋白呈“球狀”(圖3-a)，其結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)結(jié)果基本一致。配體預測分析結(jié)果表明，人(Homosapiens)的14-3-3蛋白ETA與BgtFTT1三級結(jié)構(gòu)相似，能與配體蛋白14-3-3ε(NP_006752.1)發(fā)生空間上的互作，形成復合物，大部分結(jié)合位點(第40、41、48、108、115、116、225、228、229、232、236、273、276、280、283和284位氨基酸殘基)位于C端的α-螺旋區(qū)域(圖3-b)。將14-3-3ε氨基酸序列與菌株96224蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行BLASTp比對，結(jié)果返回2個推定的14-3-3蛋白(EPQ65210.1和EPQ62128.1)，提示這些蛋白可能是候選互作靶標蛋白。

a.BgtFTT1蛋白的三級結(jié)構(gòu)圖；b.與BgtFTT1蛋白具有相似三級結(jié)構(gòu)的人類14-3-3蛋白ETA與配體蛋白互作位點圖

2.5 BgtFTT1與其他14-3-3蛋白系統(tǒng)進化關(guān)系

從其他真菌中選取8個已知功能的典型14-3-3蛋白：BMH1(CAA46959.1,S.cerevisiae)、BMH2(CAA59275.1,S.cerevisiae)、 FTT1(XP_006963731.1，Trichodermareesei)、FTT2(XP_006966399.1，T.reesei)、nfh-2(XP_964462.1，Neurosporacrassa)、rad24(CAA55795.1,S.pombe)、rad25(CAA55796.1,S.pombe)和ArtA(AAK25817.1,Aspergillusnidulans)。將 BgtFTT1與這些蛋白質(zhì)進行BLASTp比對后沒有返回符合條件的結(jié)果，說明BgtFTT1與這些蛋白質(zhì)親緣關(guān)系較遠，屬于不同的蛋白質(zhì)家族。

根據(jù)BgtFTT1在NCBI nr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中BLASTp的查詢結(jié)果，選擇14-3-3同源蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4)。5個白粉菌14-3-3蛋白與灰葡萄孢(B.cinerea)等12個兼營腐生真菌的同源蛋白處于兩個不同的分支中。在白粉菌分支中，BgtFTT1(紅色方框)與大麥白粉菌的同源蛋白親緣關(guān)系最近，構(gòu)成1個獨立的小分支，與山茱萸白粉菌、葡萄白粉菌和番茄白粉菌的14-3-3蛋白親緣關(guān)系次之。因此，白粉菌14-3-3蛋白與其他真菌14-3-3蛋白的進化距離均較遠。

圖4 BgtFTT1蛋白系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis for BgtFTT1 protein

2.6 BgtFTT1基因在小麥白粉菌自然群體中的變異

對采自全國12個省(自治區(qū))的小麥白粉菌菌株的BgtFTT1基因進行PCR檢測，結(jié)果表明，8個菌株的BgtFTT1基因ORF中第407位堿基和第644位堿基發(fā)生點突變，分別導致蛋白質(zhì)第136位氨基酸由丙氨酸(A)變?yōu)楦拾彼?G)，第215位氨基酸由蘇氨酸(T)變?yōu)楫惲涟彼?I)，均屬于非同義突變，且都在單個菌株中同時出現(xiàn)(表4)。第136位突變位于蛋白激酶C磷酸化位點附近，第215位突變位于蛋白激酶C磷酸化位點中。這兩個位點都不屬于與配體互作的氨基酸位點(圖3)。而且，突變的發(fā)生與菌株的地理來源沒有明顯的相關(guān)性。

表4 BgtFTT1基因在21個小麥白粉菌菌株中的突變位點檢測Table 4 Detection of mutation sites in BgtFTT1 among 21 Bgt isolates

a.柱形圖表示通過qRT-PCR獲得的基因相對表達量；**代表在P=0.01水平有顯著差異; b.菌株Bgt21-2在Chancellor上的產(chǎn)孢過程的臺盼藍染色照片；M.菌絲；F.足細胞； C.分生孢子梗。標尺為50 μm

2.7 BgtFTT1基因在小麥白粉菌產(chǎn)孢階段的表達動態(tài)

BgtFTT1在小麥白粉菌從營養(yǎng)生長到分生孢子產(chǎn)生階段的基因表達水平監(jiān)測結(jié)果表明，與營養(yǎng)生長階段(3 dpi)相比，BgtFTT1在足細胞形成期(4 dpi)和分生孢子梗形成期(5 dpi)均顯著上調(diào)，表達水平呈持續(xù)上升趨勢。其中，4 dpi和5 dpi時的基因表達水平分別是3 dpi時的2.6倍和4.2倍(圖5-a)。這些結(jié)果說明，BgtFTT1的功能與小麥白粉菌無性產(chǎn)孢過程相關(guān)。

3 討 論

本研究對小麥白粉菌1個14-3-3蛋白BgtFTT1的理化性質(zhì)、序列特征、功能模體和系統(tǒng)進化進行了生物信息學分析。 BgtFTT1是1個低分子質(zhì)量，偏堿性，親水性蛋白。以往的研究表明，真菌14-3-3蛋白是一類低分子質(zhì)量(約30 ku)的二聚體酸性蛋白，其中多數(shù)蛋白的親水性強于疏水性[5,32]。 BgtFTT1堿性氨基酸比酸性氨基酸多，蛋白偏堿性，這是該蛋白與其他14-3-3蛋白的主要差異之一。BgtFTT1與BMH1/BMH2等典型的14-3-3蛋白[6]沒有顯著的序列相似性，說明它們屬于不同家族的成員。而且，白粉菌的14-3-3蛋白與兼營腐生真菌的14-3-3蛋白形成兩個獨立的進化分支，說明白粉菌14-3-3蛋白可能具有與其他真菌來源的蛋白不同的進化歷史，這可能與白粉菌形態(tài)建成完全依賴于寄主的生活方式有關(guān)。

BgtFTT1不含有酶活性位點，但含有N-?；稽c、糖基化位點和PKC蛋白磷酸化位點等結(jié)合位點，提示BgtFTT1不具有催化功能，但在翻譯中或翻譯后可能發(fā)生酰基化、糖基化和磷酸化等蛋白修飾過程。?；土姿峄揎椩卺劸平湍妇?4-3-3蛋白修飾中已有發(fā)現(xiàn)[33-34]，而關(guān)于糖基化修飾還未見報道。真菌的14-3-3蛋白是一類沒有催化功能的結(jié)合蛋白，主要通過與靶標蛋白相結(jié)合來執(zhí)行它們的功能[10,35]。 BgtFTT1可能通過其C端的α-螺旋區(qū)域與其他14-3-3蛋白互作來行使其功能。而且，經(jīng)過不同修飾的14-3-3蛋白可以與不同的靶標蛋白互作，調(diào)控不同的生物學過程[36]。因此，研究BgtFTT1蛋白的修飾過程及其互作靶標蛋白將有助于進一步解析其分子功能和參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。另外，BgtFTT1在小麥白粉菌自然群體中出現(xiàn)非同義突變，且均與蛋白激酶C磷酸化位點有關(guān)，這些位點的突變是否會影響其功能，需要后續(xù)研究來 證實。

Ca2+信號通路在小麥白粉菌產(chǎn)孢過程中起重要作用[18]。蛋白激酶C是Ca2+信號通路的重要組件之一，它的激活依賴于細胞Ca2+濃度的升高[37]。 BgtFTT1具有5個蛋白激酶C磷酸化位點，說明該蛋白可能與蛋白激酶C的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān)。BgtFTT1基因在小麥白粉菌分生孢子形成階段顯著上調(diào)，說明它與小麥白粉菌產(chǎn)孢相關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3蛋白可參與Ca2+信號通路中Ca2+泵的調(diào)控，影響真菌的無性產(chǎn)孢[8,38]。BgtFTT1是否通過Ca2+信號通路調(diào)控小麥白粉菌無性產(chǎn)孢過程，可利用寄主誘導的基因沉默技術(shù)[39]將BgtFTT1沉默，檢測細胞內(nèi)Ca2+離子水平，監(jiān)測與BgtFTT1功能有關(guān)的基因和參與Ca2+離子信號通路基因表達水平的變化，結(jié)合表型分析，揭示BgtFTT1在小麥白粉菌產(chǎn)孢中的作用。