趙笑菲，陳 震，孫艷文*

(1．河北石油職業(yè)技術(shù)大學(xué) 化學(xué)工程系，河北 承德 067000；2．河北民族師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，河北 承德 067000)

葉黃素，又名“植物黃體素”，是一種廣泛存在于蔬菜、花卉、水果與某些藻類生物中的天然色素[1]，葉黃素具有很好的抗氧化性，因此對于預(yù)防人體衰老、老年性黃斑區(qū)病變、白內(nèi)障等疾病具有良好的功效, 葉黃素已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品、化妝品、飼料等領(lǐng)域[2]。隨著人們生活節(jié)奏加快，手機(jī)電腦等電子產(chǎn)品不斷更新普及，人們用眼時間和強(qiáng)度不斷加大，眼疲勞增加，老年白內(nèi)障等眼部疾病發(fā)病率不斷升高。雖然可以通過營養(yǎng)品和保健品來補(bǔ)充葉黃素，但是過量攝入葉黃素會對肝臟造成負(fù)擔(dān)，因此，建立一種簡單、高效的常見果蔬中葉黃素含量的測定方法，了解不同果蔬中葉黃素的含量對人們健康膳食具有重要意義。

葉黃素具有熱不穩(wěn)定性，低溫避光保存蔬菜水果能夠有效防止其所含葉黃素發(fā)生異構(gòu)化或者降解[3]。本文采用超聲波輔助有機(jī)溶劑提取常見果蔬中的葉黃素，對萃取劑的種類，萃取溫度，萃取時間，堿度等實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了最佳實驗條件，在最佳實驗條件下建立了一種簡便，高效，可信度高的紫外可見分光光度法對葉黃素含量進(jìn)行測定的方法，并對承德市售常見果蔬中葉黃素的含量進(jìn)行了測定。

1 儀器與試劑

1.1 試劑

葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品(純度89%)購自斯坦福分析化學(xué)公司；無水乙醇(分析純)，甲醇(分析純)，乙酸乙酯(分析純)，環(huán)己烷(分析純)，二氯甲烷(分析純)，石油醚(分析純)，四氫呋喃(分析純)購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計(T6)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；超聲波清洗器(KQ-100E)，昆山市超聲儀器有限公司；離心機(jī)(800)，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；粉碎機(jī)(BJ-150)，永康市鉑歐五金制品有限公司。

2 實驗步驟

2.1 溶液的配制

2.1.1 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

準(zhǔn)確稱取0.010 0 g葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品(89%)于燒杯中，用無水乙醇溶解后定量轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶，定容，搖勻，配制成濃度為100 μg/mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，冷藏避光保存。

2.1.2 不同濃度的NaOH無水乙醇溶液的配制

分別稱取0.5 g，1.0 g，2.0 g，3.0 g，4.0 g，5.0 g NaOH于小燒杯中，用無水乙醇溶解，制成濃度為5%，10%，20%，30%，40%，50%的NaOH無水乙醇溶液備用。

2.2 樣品預(yù)處理

用自來水將蘋果洗凈，用蒸餾水沖洗，避光晾干，蘋果去核切片，香蕉去皮切片，菠菜和甘藍(lán)去除壞葉，在電子天平上稱量20.000 0 g；烘箱溫度設(shè)定為60 ℃，準(zhǔn)確稱取烘干后蘋果片、香蕉片、菠菜和甘藍(lán)的質(zhì)量；將烘干的蘋果片、香蕉片、菠菜和甘藍(lán)用粉碎機(jī)粉碎，研磨，過60目篩[4]。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液槍分別移取50 μL，100 μL，150 μL，200 μL，250 μL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液于樣品瓶中，分別加入無水乙醇2 450 μL、2 400 μL、2 350 μL、2 300 μL、2 250 μL，搖勻，配制成終濃度為2 μg/mL，4 μg/mL，6 μg/mL，8 μg/mL，10 μg/mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

以4 μg/mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液為待測樣品，以無水乙醇為空白樣品，用紫外可見分光光度計在440～490 nm波長范圍，每間隔1 nm測定其吸光度，繪制葉黃素的吸收曲線，并確定其最大吸收波長。

在最大吸收波長下，以無水乙醇作為空白樣品，分別測定0 μg/mL，2 μg/mL，4 μg/mL，6 μg/mL，8 μg/mL，10 μg/mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以葉黃素的濃度c為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線。

2.4 超聲波輔助有機(jī)溶劑萃取條件的優(yōu)化

2.4.1 萃取劑的優(yōu)化

稱取7份0.020 0 g菠菜粉末分別放入50 mL燒杯中，依次加入四氫呋喃，石油醚，無水乙醇，甲醇，環(huán)己烷，乙酸乙酯，二氯甲烷各24 mL，1 mL 30%的NaOH無水乙醇溶液，在超聲波功率100 W，溫度30 ℃條件下避光超聲30 min后，混合液離心3 min，取上清液，在紫外可見分光光度計上，在最大吸收波長下測定其吸光度。

2.4.2 萃取溫度的優(yōu)化

稱取5份0.020 0 g菠菜粉末分別放入50 mL燒杯中，各加入24 mL無水乙醇，1 mL 30%的NaOH無水乙醇溶液，依次在10 ℃，20 ℃，30 ℃，40 ℃，50 ℃，超聲波功率100 W的條件下，避光超聲30 min?；旌弦弘x心3 min，取上清液，在紫外可見分光光度計上，在最大吸收波長下測定其吸光度。

2.4.3 萃取時間的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取6份0.020 0 g菠菜粉末分別放入50 mL燒杯中，加入24 mL無水乙醇，1 mL 30%的NaOH無水乙醇溶液，在超聲波功率100 W，溫度30 ℃下，避光超聲時間分別為10 min，20 min，30 min，40 min，50 min，60 min，混合液離心3 min，取上清液，在紫外可見分光光度計上，在最大吸收波長下測定其吸光度。

2.4.4 堿度的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取6份0.020 0 g菠菜粉末分別放入50 mL燒杯中，各加入24 mL無水乙醇，依次加入5%，10%，20%，30%，40%，50% NaOH無水乙醇溶液各1 mL，在30 ℃下，超聲波功率100 W下，避光超聲30 min?；旌弦弘x心3 min，取上清液，在紫外可見分光光度計上，在最大吸收波長下測定其吸光度。

2.5 承德市售常見果蔬中葉黃素含量的測定

2.5.1 樣品中葉黃素含量的測定

分別稱取蘋果粉末1.000 0 g，香蕉粉末1.000 0 g，菠菜粉末0.020 0 g，甘藍(lán)粉末0.100 0 g于5個50 mL燒杯中，各加入24 mL無水乙醇， 1 mL 30%的NaOH無水乙醇溶液，在超聲波功率100 W，溫度30 ℃下，避光超聲50 min，混合液離心3 min，取上清液，在紫外可見分光光度計上，在最大吸收波長下測定其吸光度。

3 結(jié)果與討論

3.1 葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)不同波長下葉黃素的吸光度繪制其吸收曲線(圖1)，發(fā)現(xiàn)在452 nm和482 nm處出現(xiàn)峰值。其中波長為452 nm處溶液吸光度為0.451，波長為482 nm處溶液吸光度為0.403，因此，確定葉黃素的最大吸收波長為452 nm。根據(jù)葉黃素的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在452 nm波長下的吸光度繪制葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。葉黃素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在0～10 μg/mL范圍內(nèi)線性回歸方程為Y=0.111 31X+0.001 1，相關(guān)系數(shù)R=0.999 87，線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度較高，可以用于葉黃素的定量分析。

3.2 溶劑種類對萃取液中葉黃素含量的影響

葉黃素作為一種脂溶性色素，不溶于水，溶于有機(jī)溶劑[3]。通過對不同溶劑作為萃取劑時萃取液中葉黃素的含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)萃取液中葉黃素的含量大小順序為甲醇>四氫呋喃>無水乙醇>石油醚>二氯甲烷>環(huán)己烷>乙酸乙酯，甲醇的萃取效果最好。其中，甲醇，四氫呋喃，無水乙醇，石油醚，二氯甲烷作為萃取劑時萃取效率相差不大，考慮到綠色環(huán)保及節(jié)約實驗成本，選擇無水乙醇作為萃取劑。

3.3 萃取溫度對萃取液中葉黃素含量的影響

通過對不同萃取溫度下萃取液中葉黃素的含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)隨著萃取溫度的升高，萃取液中葉黃素的含量逐漸增大，當(dāng)萃取溫度為30 ℃時，萃取液中葉黃素的含量最大。萃取溫度繼續(xù)升高，葉黃素的含量反而逐漸減小(圖4)。這是可能由于當(dāng)萃取溫度低于30 ℃時，隨著萃取溫度越高，葉黃素越容易溶解到萃取劑中，當(dāng)溫度為30 ℃時，葉黃素在萃取劑中的溶解達(dá)到飽和，萃取溫度繼續(xù)升高，會使部分葉黃素發(fā)生降解或者異構(gòu)化，反而使葉黃素的含量降低。因此，確定30 ℃作為最佳萃取溫度。

3.3 萃取時間對萃取液中葉黃素含量的影響

通過對不同萃取時間下萃取液中葉黃素的含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)隨著萃取時間的延長，萃取液中葉黃素的含量逐漸增大，當(dāng)萃取時間為50 min時，萃取液中葉黃素的含量最大。50 min以后，萃取液中葉黃素含量減小(圖5)，這是可能是由與當(dāng)萃取時間超過50 min以后，部分葉黃素被空氣中的氧氣氧化分解，使葉黃素的含量下降。因此，確定50 min作為最佳萃取時間。

3.3 NaOH濃度對萃取液中葉黃素含量的影響

葉黃素是一種廣泛存在與蔬菜、水果中的天然色素，但其存在形式有差別，在綠色蔬菜、水果中存在的葉黃素以游離非酯化形式存在，在黃色或橙色水果、蔬菜中的葉黃素以葉黃素酯的形式存在，需進(jìn)行皂化處理[1]。同時皂化反應(yīng)可被用來去除萃取物中的脂肪和葉綠素，減少對葉黃素測定的干擾[5]。通過測定不同NaOH濃度下萃取液中葉黃素的含量，發(fā)現(xiàn)隨著NaOH濃度的增大，萃取液中葉黃素的含量逐漸增大，當(dāng)NaOH濃度為40%時，葉黃素的含量最大。當(dāng)NaOH濃度繼續(xù)增加時，葉黃素的含量反而減小(圖6)。這說明雖然增加NaOH的濃度促進(jìn)葉黃素酯解離為葉黃素單體，去除萃取物中脂肪和葉綠素對葉黃素測定的干擾，但是NaOH的濃度過高，會影響葉黃素的穩(wěn)定性，反而使葉黃素的含量減少。因此，確定最佳NaOH濃度為40%。

3.4 承德市售常見果蔬中葉黃素含量的測定

以無水乙醇作為萃取劑，在30 ℃下萃取50 min作為最佳果蔬中葉黃素的萃取條件，以NaOH含量為40%，對承德市售四種常見果蔬中葉黃素含量進(jìn)行了測定(見表1)。實驗結(jié)果表明：新鮮果蔬中葉黃素含量的大小順序為：菠菜>甘藍(lán)>蘋果>香蕉。

表1 承德市售常見果蔬中葉黃素的含量

3.4 實驗方法的精密度

取4 μg/mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在紫外可見分光光度計上，在最大吸收波長452 nm下測定其吸光度，該樣本中葉黃素含量的測定重復(fù)性系數(shù)為0.079%(見表2)。

表2 實驗方法精密度

3.5 實驗方法的加標(biāo)回收率

取5.0 mL果蔬萃取上清液(蘋果、香蕉、菠菜、甘藍(lán))至比色管中，分別加入1.0 mL濃度為4 μg/mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加無水乙醇溶液定容到10 mL。在紫外可見分光光度計上，在波長452 nm下測定其吸光度，平行三次實驗，計算葉黃素的含量，并計算加樣回收率(表3)。承德市售四種常見果蔬中加標(biāo)回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.61%，3.839%，4.44%，0.59%，能夠滿足檢測實際樣品的檢測需要。

表3 承德市售常見果蔬樣品加標(biāo)回收率

4 結(jié)論

本文建立了一種紫外可見分光光度法測定承德市售常見果蔬中葉黃素含量的方法。葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.001 1X+0.111 31，R2=0.999 7，葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液在0～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。通過對超聲波輔助提取承德市售常見果蔬中葉黃素的實驗條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳萃取條件為以無水乙醇作為萃取劑，萃取溫度為30 ℃，萃取時間為50 min，NaOH的含量為40%。在最佳實驗條件下，對承德市售常見果蔬中葉黃素的含量進(jìn)行了測定，實驗結(jié)果表明：承德市售常見的四種果蔬中葉黃素含量高低順序為菠菜>甘藍(lán)>蘋果>香蕉，其中新鮮菠菜中葉黃素含量最高為0.386 mg/g。該方法加標(biāo)回收率能夠滿足檢測實際樣品的檢測需要，可以用于葉黃素的定量分析。